細胞紅蛋白在低氧預適應小鼠大腦組織中的表達及其臨床意義

黃麗華，邵 國，賈平平，張 冬

·論著·

細胞紅蛋白在低氧預適應小鼠大腦組織中的表達及其臨床意義

黃麗華，邵 國，賈平平，張 冬

目的 探討細胞紅蛋白(CYGB)在低氧預適應小鼠大腦組織中的表達及其臨床意義。方法 2014年11月8—12日，選取昆明種雄性成年小鼠60只，隨機分為空白對照組、實驗對照組和低氧預適應組，每組20只。空白對照組小鼠常氧條件下正常飼養，實驗對照組小鼠進行1次低氧預適應模型制備過程，低氧預適應組小鼠完成4次低氧預適應模型制備過程。采用免疫蛋白印跡試驗檢測各組小鼠CYGB蛋白表達情況，實時定量PCR檢測各組小鼠CYGB mRNA表達情況。結果 低氧預適應組小鼠CYGB蛋白相對表達量高于空白對照組和實驗對照組，實驗對照組小鼠CYGB蛋白相對表達量高于空白對照組(P<0.01)。低氧預適應組、實驗對照組小鼠CYGB mRNA表達量高于空白對照組(P<0.01)，而實驗對照組與低氧預適應組小鼠CYGB mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論 低氧預適應是一種內源性保護機制，CYGB可能參與低氧預適應過程。

低氧預適應；海馬；細胞紅蛋白；小鼠

近年研究發現，低氧預適應是機體耐受低氧或缺血損傷的內源性保護機制，其定義為：預先給予機體一個亞致死性低氧/缺血刺激可增強機體對隨后發生的致死性低氧/缺血的耐受性，低氧預適應已被證實為細胞內源性防護機制的啟動因子[1]。低氧預適應的作用機制一直是國內外研究的熱點，Shao等[2]研究認為，急性重復低氧預適應的細胞組織分子作用機制可能是抑制腦組織損傷基因上調，促進腦組織損傷基因下調。細胞紅蛋白(CYGB)是近年研究發現的第4種攜氧球蛋白[3]，廣泛分布于腦神經元胞質和胞核[4-5]，在機體缺氧應激過程中具有重要的組織細胞保護作用[6-7]。腦組織中海馬區對低氧/缺血較敏感，本研究通過制備急性重復低氧預適應小鼠模型，探討CYGB在低氧預適應小鼠大腦組織中的表達及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 昆明種雄性成年小鼠60只，體質量18～22 g，周齡6～8周，由內蒙古大學動物實驗中心提供。主要試劑：Tris堿購自SIGMA公司，丙烯酰胺購自SIGMA公司，DEMD購自SIGMA公司；BCA蛋白試劑盒購自PIERCE公司，ECL試劑盒購自PIERCE公司；β-actin兔多克隆抗體購自Santa Cruze公司，Cytoglobin兔多克隆抗體購自Santa Cruze公司，辣根酶標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Kodak X-Omat BT Film購自Kodak公司；TRIzol(GIBCO BRL)、溴化乙啶(EB)、三氯甲烷購自重慶化學試劑廠，異丙醇和乙醇購自博奧公司。

1.2 動物模型制備 2014年11月8—12日，將所有小鼠隨機分為空白對照組、實驗對照組和低氧預適應組，每組20只，空白對照組小鼠常氧條件下正常飼養；實驗對照組和低氧預適應組小鼠參照呂國蔚教授[8-9]模型制備方法制備急性重復低氧預適應模型：先將小鼠置于經過標定的125 ml廣口瓶內，使用橡皮塞密閉瓶口，并進行觀察，當小鼠出現大口喘式呼吸、翻轉反射消失、大小便失禁、煩躁不安和不停跳躍等低氧表現時立即拔除橡皮塞，將小鼠取出，小鼠第1次低氧完成(實驗對照組)；第1次低氧完成后，立即將小鼠轉移至另一相同容積且含有新鮮空氣的廣口瓶內，迅速使用橡皮塞密閉并再次進行觀察，小鼠出現上述低氧癥狀時取出，上述步驟重復4次(低氧預適應組)。模型制備完成后對所有小鼠進行斷頭處死，迅速小心剝離海馬組織，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 免疫蛋白印跡試驗 取各組小鼠海馬組織勻漿液，采用BCA 法進行總蛋白定量并配置樣品緩沖液，每組小鼠取緩沖液60 μg上樣，配置成10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳約2 h；電泳完成后將膠上的總蛋白通過轉膜器轉到硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封固1 h后采用Cytoglobin兔多克隆抗體稀釋液進行稀釋，稀釋比例為1∶8 000，孵育4 h，4 ℃冰箱過夜；采用TTBS洗膜3次，辣根過氧化物酶標記二抗，1∶5 000稀釋，孵育硝酸纖維膜，TTBS洗膜3次，將ECL化學發光試劑按比例加在硝酸纖維膜上，暗房X線膠片上曝光、顯影、定影。以β-actin為內參照，采用凝膠成像分析系統掃描膠片，以目的蛋白條帶面積/β-actin面積為CYGB蛋白相對表達量。

1.4 實時定量PCR 采用Triziol提取各組小鼠海馬組織總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將總mRNA反轉錄為cDNA，總量為20 μl，置于-20 ℃冰箱保存；在含ABI的96孔板中依次在每孔中加入cDNA 1 μl，上、下游引物各12.5 μl，無菌水等；之后將96孔板置于7900實時定量PCR反應儀上，每個樣本設6個復孔；實時定量PCR反應條件：95 ℃變性2 min，94 ℃，30 s；56 ℃，35 s，72 ℃，30 s，共40個循環；72 ℃延伸7 min后停止反應。實時定量PCR反應引物序列：CYGB上游引物：3′-CCATCCTGGTGAGGTTCTTT-5′，下游引物3′-CTTCCTTGTAGGCTGCGGT-5′；β-actin 上游引物：3′-GAACGGTGAAGGCGACAG-5′，下游引物：3′-TTGGGAGGGTGAGGGACT-5′。以β-actin 為內參，CYGB mRNA相對表達量以2-△△CT表示，△CT=CT目的基因-內參基因。

2 結果

2.1 CYGB蛋白表達情況 空白對照組小鼠CYGB蛋白相對表達量為(0.358±0.047)，實驗對照組為(0.469±0.083)，低氧預適應組為(0.732±0.065)，3組小鼠CYGB蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義(F=166.150，P=0.000)；低氧預適應組小鼠CYGB蛋白相對表達量高于空白對照組和實驗對照組，差異有統計學意義(q值分別為25.098、17.649，P<0.01)，實驗對照組小鼠CYGB蛋白相對表達量高于空白對照組，差異有統計學意義(q=7.449，P<0.01，見圖1～2)。

圖1 3組小鼠CYGB電泳圖

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與實驗對照組比較，bP<0.01

圖2 3組小鼠CYGB蛋白相對表達量比較

Figure 2 Comparison of CYGB protein expression among the three groups

2.2 CYGB mRNA表達情況 空白對照組小鼠CYGB mRNA相對表達量為(23.00±4.90)，實驗對照組為(33.85±6.40)，低氧預適應組為(38.60±10.24)，各組小鼠CYGB mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義(F=22.590，P=0.000)。低氧預適應組、實驗對照組小鼠CYGB mRNA表達量高于空白對照組，差異有統計學意義(q值分別為9.273、6.449，P<0.01)，而實驗對照組與低氧預適應組小鼠CYGB mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義(q=2.823，P>0.05，見圖3)。

注：與空白對照組比較，aP<0.05

圖3 3組小鼠CYGB mRNA相對表達量比較

Figure 3 Comparison of CYGB mRNA expression among the three groups

3 討論

氧是細胞、組織代謝和維持生命的重要物質，在與氧相關儲存和轉運生理過程中，攜氧球蛋白——血紅蛋白和肌紅蛋白發揮著重要作用。2002年，Burmester在人類和小鼠體內發現了第4種攜氧球蛋白——CYGB，其廣泛分布于人體各組織和器官，具有攜氧和運輸氧功能[3，10]。大量研究表明，組織和細胞缺氧時CYGB表達明顯上調，這可能是組織細胞自我保護的機制之一[11-13]。

腦低氧預適應是腦組織對低氧/缺血的一種內源性防護機制，自從腦低氧預適應被發現以來，大量研究對其作用機制進行了探討和分析，提出了包括氧化應激、一氧化氮作用、低溫等在內的多種假說，但其確切作用機制目前尚不清楚。鑒于CYGB在組織缺氧中的重要作用，探討CYGB在低氧預適應小鼠大腦組織中的表達對闡明低氧預適應作用機制具有重要意義。

馬海然等[14]在體外培養的神經元中發現，CYGB mRNA及蛋白表達量隨低氧時間延長而增高，推測CYGB可能參與低氧預適應及腦保護作用；本研究結果顯示，低氧預適應組小鼠CYGB蛋白相對表達量高于空白對照組和實驗對照組，實驗對照組小鼠CYGB蛋白相對表達量高于空白對照組，低氧預適應組、實驗對照組小鼠CYGB mRNA表達量高于空白對照組，與上述文獻報道結果基本一致。本課題組前期研究結果顯示，急性重復低氧可上調低氧誘導因子1(HIF-1)的表達[15-16]；Wystub等[17]研究發現，CYGB啟動子的上游基因序列包含能與HIF-1特異位點結合的低氧應答元件(HREs)，并在3′端非翻譯區發現了保守的可經缺氧誘導的mRNA信號位點，因此推測低氧預適應過程中HIF-1促進了CYGB的轉錄，進而導致CYGB表達上調。CYGB參與低氧預適應及腦保護作用的可能機制主要有以下幾個方面：(1)CYGB能夠通過與NO緊密結合而清除低氧/缺血導致的機體分泌的過量NO[18]，從而避免過量的NO對神經元造成損傷；(2)CYGB具有過氧化物酶和超氧化物歧化酶作用[19]，可利用亞鐵原卟啉和硫醇殘基清除活性氧，能在氧化應激時保護細胞免受損傷；(3)CYGB具有過氧化氫酶作用，能促進糖酵解和ATP生成，在低氧/缺血時為細胞提供能量[20]；(4)低氧環境下，有氫離子和還原性物質存在時，CYGB易發生變構而利于釋放氧，從而更好地發揮運輸氧和儲氧功能。

綜上所述，低氧預適應是一種內源性保護機制，CYGB可能參與低氧預適應過程，但其具體作用機制目前尚不清楚，如能分離、純化或在體外合成低氧預適應過程中產生的具有腦保護物質，這將為臨床防治腦卒中或其他低氧缺血疾病提供新選擇，本研究擬在今后的研究中通過敲除小鼠CYGB基因而進一步驗證CYGB在低氧預適應中的作用。

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(本文編輯：鹿飛飛)

Expression and Clinical Significance of Cytoglobin in Brain Tissue of Hypoxia Preconditioning Mice

HUANGLi-hua，SHAOGuo，JIAPing-ping，etal.

PublicHealthSchoolofBaotouMedicalCollege，Baotou014010，China

Objective To explore the expression and clinical significance of cytoglobin in brain tissue of hypoxia preconditioning mice.Methods From November 8 to 12 in 2014，a total of 60 Kunming species male adult mice were randomly divided into A group，B group and C group，each of 20 mice.Mice of A group were normally feed in normal oxygen content，mice of B group were prepared for hypoxia preconditioning model for one time，while mice of C group were prepared for hypoxia preconditioning model for four times.Immune protein imprinting test was used to detect the cytoglobin protein expression，real-time quantitative PCR was used to detect the cytoglobin mRNA expression.Results The relative cytoglobin protein expression of C group was statistically significantly higher than that of B group and A group，respectively，and relative cytoglobin protein expression B group was statistically significantly higher than that of A group(P<0.01).The relative cytoglobin mRNA expression of C group and B group was statistically significantly higher than that of A group，respectively(P<0.01)，while no statistically significant differences of relative cytoglobin mRNA expression was found between B group and C group(P>0.05).Conclusion Hypoxia preconditioning is a kind of endogenesis protect mechanisms，and cytoglobin maybe play an important role in the process.

Hypoxia preconditioning；Hippocampus；Cytoglobin；Mice

國家自然科學基金(81160244)；內蒙古自治區高等學校科學研究項目(NJZY12225)

014010內蒙古包頭市，包頭醫學院公共衛生學院(黃麗華，張冬)，生物醫學中心(邵國)，藥學院(賈平平)

黃麗華，邵國，賈平平，等.細胞紅蛋白在低氧預適應小鼠大腦組織中的表達及其臨床意義[J].實用心腦肺血管病雜志，2015，23(7)：43-46.[www.syxnf.net]

R 854.22 R 332

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.07.012

2015-04-15；

2015-07-10)

Huang LH，Shao G，Jia PP，et al.Expression and clinical significance of cytoglobin in brain tissue of hypoxia preconditioning mice[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(7)：43-46.