黑尾胡蜂毒液抗菌肽的分離純化及功能研究

王 瀅，張廣求，屈 睿，潘世甜，李素娟

(云南民族大學 民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500)

黑尾胡蜂毒液抗菌肽的分離純化及功能研究

王 瀅，張廣求，屈 睿，潘世甜，李素娟

(云南民族大學 民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500)

由于病原微生物對眾多傳統抗生素藥物的耐藥性問題日益突顯，因此尋找新型的抗菌藥物顯得尤為緊迫，多肽類制劑因其具有廣譜的抗菌活性，已成為克服病原微生物耐藥性的潛在候選藥物.從黑尾胡蜂毒液中分離并鑒定了一種具有抗菌活性的多肽,命名為VT-1.VT-1對臨床致病菌均表現出廣譜的抗菌活性.此外，VT-1對人紅細胞顯示出微弱的溶血活性.

黑尾胡蜂；毒腺；抗菌肽

生物體隨時隨地都面臨著微生物的挑戰，它們需要發展出一套有效的防御機制以抵御微生物病原體的侵襲.抗菌肽作為抵御微生物入侵的第一道防線，有極其重要的功能，尤其是沒有后天免疫系統的無脊椎動物和后天免疫系統脆弱的低等脊椎動物，必須依靠主要由抗菌肽組成的先天免疫系統來抵御病原微生物的感染.特別是昆蟲，它們體內沒有抗體、胸腺及免疫細胞，基本依賴抗菌肽擔負免疫功能.盡管抗菌多肽作為古老的天然抗微生物的物質，擔負了極其重要的免疫功能，可是受到關注也還不到半個世紀.最近，由于面臨著不斷涌現的大量的對傳統抗生素藥物具有耐藥性的微生物的嚴峻挑戰，抗菌多肽才引起了世人的極大關注.抗菌多肽具有抗菌活性高、抗菌譜廣等優點，同時還不易引起微生物的耐藥性[1].

胡蜂是一味傳統的重要動物藥材，其藥用已有 2 000 多年的歷史[2].世界上已知的胡蜂種類有 5 000 多種，中國記載的有200余種，其中黑尾胡蜂(Vespatropica)在云南省普洱、雙柏等地區多有分布，并在民族藥中占有極其重要的地位，且被收錄到《藥用動物與動物藥》、《動物本草》等眾多藥典中.黑尾胡蜂屬昆蟲綱膜翅目胡蜂科，又名雙金環虎頭蜂，其成蟲、幼蟲和蜂巢皆可入藥，有殺蟲、消腫、解毒的功能[3-4]；外用治癰疽惡瘡、潰后不斂.本文以黑尾胡蜂為研究對象，通過Sephadex G-50、RP-HPLC等技術分離純化到一條抗菌肽，命名為VT-1，從而為黑尾胡蜂抗菌肽的深入研究奠定了一定的基礎.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

黑尾胡蜂(Vespatropica)采自云南省普洱市，Sephadex G-50為Amersham Biosciences產品，實驗用大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草桿菌(Bacilussubttilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccusaureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)等菌株由本實驗室保存.

1.2 實驗儀器設備

上海亞榮生化儀器廠2.6 cm×100 cm層析柱、HL-2B數顯恒流泵、Bs-100A自動部分收集器，Eppendorf公司5810R高速冷凍離心機，寧波萊福科技有限公司PSX智能型恒溫恒濕培養箱，Ultrospec 2100 pro紫外/可見分光光度計(Amersham Bioscience公司)，Waters 600-2489高效液相色譜儀，大連伊利特Hypersil C18反相柱.

1.3 方法

1.3.1 黑尾胡蜂毒液的提取

采用電刺激取毒的方法，步驟如下：用6V的直流電刺激胡蜂數秒，此時胡蜂釋放毒液至1.5 mL離心管中.12 000 r·min-1離心10 min后，取上清液，-20 ℃保存備用.

1.3.2 黑尾胡蜂毒液中抗菌肽的分離純化

以收集的上述黑尾胡蜂毒液為原料，按照下述步驟進行純化，分離純化的每一個步驟都進行抗菌活性跟蹤檢測，具體操作方法見下述：

第1步，葡聚糖凝膠過濾層析Sephadex G-50： 將體腔液上清上樣于已用0.1 M磷酸鹽(Na2HPO4-NaH2PO4)pH 6.0緩沖液平衡好的Sephadex G-50凝膠過濾柱(superfine，100×2.6 cm，GE Healthcare)，然后用同樣的緩沖液進行洗脫，自動部分收集器收集，流速為0.3 mL/min，每10 min收集1管，使用Ultrospec 2100 pro紫外/可見分光光度計檢測每管樣品的OD280紫外吸收值，繪制峰形圖，合并樣品，洗脫結束后收集各峰做抗菌活性檢測，凍干備用.

第2步，反相高壓液相層析RP-HPLC：將Sephadex G-50凝膠過濾所得到的活性成分峰重新溶于pH 6.0，0.1 M的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，4℃，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液后于Waters 600-2489液相色譜儀上分析.采用反相C18分析柱(Hypersil BDS C18，30×0.46 cm)，以超純水(含 0.1% 三氟乙酸)和乙腈(含0.1%三氟乙酸)構成的洗脫系統進行梯度洗脫，檢測OD215紫外吸收值，流速0.7 mL/min.收集得到的各峰冷凍干燥濃縮，用滅菌的去離子水重新溶解并檢測各峰的抗菌活性，活性部分凍干備用.

1.3.3 抗菌活性檢測

采用抑菌圈法檢測多肽的抗菌活性.在LB平板培養基中分別涂布大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌等臨床致病菌，在直徑為1 cm的濾紙片上分別滴加20 μL經上述分離純化得到的多肽(分離峰)，以無菌水為對照，37℃恒溫培養，觀察濾紙片周圍是否有抑菌圈，并度量抑菌圈的大小.抗菌活性用抑菌圈直徑表示(數值等于抑菌圈外徑減濾紙直徑).

1.3.4 溶血活性檢測

根據文獻已經報道的方法采用人紅細胞檢測純化到的抗菌肽的溶血活性[5].簡要步驟如下：用PBS緩沖液洗滌人紅細胞2次，之后用PBS重懸并稀釋到5%濃度的懸浮液.上述稀釋好的懸浮液與不同濃度的樣品在37 ℃保溫30 min，再于200 r·min-1離心5 min，上清液于595 nm測吸收值.陽性對照使用Triton X-100.溶血活性與595 nm吸收值成正比.

2 結果與討論

2.1 分離純化

黑尾胡蜂毒液Sephadex G-50凝膠層析圖譜如圖1A(280 nm處吸收量)所示，分別收集到Ⅰ峰、Ⅱ峰、Ⅲ峰、Ⅳ峰共4個峰.其中Ⅲ峰用RP-HPLC(C18)進一步分離純化，分離圖譜見圖1B(215 nm處吸收量)，其中箭頭所示的峰顯示很強的抗菌活性.

2.2 一級結構分析

黑尾胡蜂經凝膠層析和RP-HPLC分離純化后得到的抗菌活性肽用Edman降解法進行N端測序，得到其氨基酸序列為：FIPIIGKLLSGLL.經MALDI-TOF檢測，得到其分子質量為 1 384.0 u，與理論計算得到的分子質量 1 383.7 u相吻合，將該抗菌活性肽命名為VT-1.

2.3 抗菌活性

VT-1對4種標準臨床致病菌均表現出廣譜的抗菌活性，實驗結果如圖2所示.

2.4 溶血活性

實驗結果表明VT-1在100 μg/mL質量濃度下也不會引起人紅細胞發生溶血，對人紅細胞無毒性作用.

3 結語

近幾十年間，越來越多的研究關注胡蜂的毒液成分.普遍認為胡蜂毒液中的活性物質主要由以下3種物質組成：1)大分子蛋白質，如各種酶類、過敏原等；2)生物活性胺，包括組胺，5-羥色胺等；3)小肽分子，包括肥大細胞脫粒肽、趨化肽等[3,6-7].研究人員已從多種胡蜂種類的毒液中純化并鑒定得到這些小肽分子[5-6,8-13]，然而，胡蜂抗菌活性方面的研究卻為數不多[4,14-17].在本工作中，我們從黑尾胡蜂毒液中鑒定得到一條新的抗菌肽，并測得其成熟肽的氨基酸序列.

在全世界范圍內，細菌對現今普遍使用的抗生素的耐藥性已極大地威脅到人類的健康.因此，開發新型的抗菌及抗感染藥物迫在眉睫.抗菌肽在自然界中廣泛分布，并且已從許多不同的動物種屬中純化鑒定得到多種抗菌肽，包括脊椎動物、魚類、兩棲動物、鳥類及哺乳動物[1].綜上所述，本研究可能對設計及合成新型的具有藥用潛力的抗菌肽提供有效的分子模板，同時豐富我們對黑尾胡蜂毒液組分的認識.

[1] JENSSEN H,HAMILL P,HANCOCK R E W.Peptide antimicrobial agents[J].Clinical microbiology reviews,2006,19(3):491-511.

[2] AN S,CHEN L,WEI J F,et al.Purification and characterization of two new allergens from the venom of Vespa magnifica[J].PloS one,2012,7(2):e31920.

[4] CHEN W,YANG X,YANG X,et al.Antimicrobial peptides from the venoms ofVespabicolorFabricius[J].Peptides,2008,29(11):1887-1892.

[5] BIGNAMI G S.A rapid and sensitive hemolysis neutralization assay for palytoxin[J].Toxicon,1993,31(6):817-820.

[6] ARGIOLAS A,PISANO J J.Isolation and characterization of two new peptides,mastoparan C and crabrolin,from the venom of the European hornet,Vespacrabro[J].Journal of Biological Chemistry,1984,259(16):10106-10111.

[7] HABERMANN E.Bee and wasp venoms[J].Science,1972,177(4046):314-322.

[8] 平井裕子,安原義,吉田久信,等.A new mast cell degranulating peptide“mastoparan”in the venom of Vespula lewisii[J].Chemical and pharmaceutical bulletin,1979,27(8):1942-1944.

[9] HO C L,CHEN W C,LIN Y L.Structures and biological activities of new wasp venom peptides isolated from the black-bellied hornet(Vespabasalis)venom[J].Toxicon,1998,36(4):609-617.

[10] LEHRER R I,ROSENMAN M,HARWIG S S S L,et al.Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides[J].Journal of immunological methods,1991,137(2):167-173.

[12] VAARA M.New approaches in peptide antibiotics[J].Current opinion in pharmacology,2009,9(5):571-576.

[13] ZASLOFF M.Magainins,a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation,characterization of two active forms,and partial cDNA sequence of a precursor[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1987,84(15):5449-5453.

[14] KRISHNAKUMARI V,NAGARAJ R.Antimicrobial and hemolytic activities of crabrolin,a 13-residue peptide from the venom of the European hornet,Vespa crabro,and its analogs[J].The Journal of peptide research,1997,50(2):88-93.

[15] LIN C H,TZEN J T C,SHYU C L,et al.Structural and biological characterization of mastoparans in the venom ofVespaspecies in Taiwan[J].Peptides,2011,32(10):2027-2036.

[16] PARK N G,YAMATO Y,LEE S,et al.Interaction of mastoparan-B from venom of a hornet in taiwan with phospholipid bilayers and its antimicrobial activity[J].Biopolymers,1995,36(6):793-801.

[17] XU X,LI J,LU Q,et al.Two families of antimicrobial peptides from wasp(Vespamagnifica)venom[J].Toxicon,2006,47(2):249-253.

(責任編輯 梁志茂)

獲獎簡訊

2014年12月26日，教技發中心函〔2014〕139號文件公布了2013年度“中國科技論文在線優秀期刊”暨“中國科技論文在線科技期刊優秀組織單位”評選結果。云南民族大學學報自然科學版獲評教育部科技發展中心“中國科技論文在線優秀期刊”二等獎。教育部科技發展中心對截至2013年12月31日已收錄在“中國科技論文在線”的教育部主管的期刊，經過嚴格的評審評選出“中國科技論文在線優秀期刊”一等獎共79項(其中自然科學25項，工程技術22項，醫藥衛生9項，農業科學5項，人文社科18項);二等獎142項(其中自然科學38項，工程技術37項，醫藥衛生13項，農業科學18項，人文社科36項)；評選出“中國科技論文在線科技期刊優秀組織單位”61個。

Purification and functions of the antimicrobial peptide from the venom gland of the social waspVespatropica

WANG Ying，ZHANG Guang-qiu，QU Rui，PAN Shi-tian,LI Su-juan

(Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education of China,Yunnan Minzu University,Kunming 650031,China)

Peptide agents are regarded as potential candidates for overcoming the life-threatening resistance of pathogenic microorganisms to classic antibiotics. This research has identified an antimicrobial peptide,namely VT-1 from the venom gland of the waspVespatropica, by using the combined methods of peptidomics and genomics. VT-1 has exerted a broad-spectrum antimicrobial activity against standard and clinically isolated strains of bacteria. In addition,VT-1 shows a weak hemolytic activity toward human erythrocytes.

Vespatropica; venom gland; antimicrobial peptide

2015-01-05.

國家自然科學基金(31460571)；民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室開放基金(MZY1403)；云南民族大學青年基金科研項目(2013QN24)；云南民族大學引進人才科研項目(2014RC005).

王瀅(1984-)，女，博士，講師.主要研究方向:藥用活性分子的藥理藥效學.

S482.2

A

1672-8513(2015)02-0119-04