濟生腎氣湯聯合骨髓間充質干細胞移植對肝硬化大鼠T淋巴細胞亞群及紅細胞免疫功能的影響研究

劉瑩，周曉玲，謝勝，侯秋科，李澤鵬，陳峭，李燦，韋金秀

·中醫·中西醫結合研究·

濟生腎氣湯聯合骨髓間充質干細胞移植對肝硬化大鼠T淋巴細胞亞群及紅細胞免疫功能的影響研究

劉瑩，周曉玲，謝勝，侯秋科，李澤鵬，陳峭，李燦，韋金秀

目的探討濟生腎氣湯聯合骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植對肝硬化大鼠T淋巴細胞亞群及紅細胞免疫功能的影響。方法2014年10—12月，采用隨機數字表法將造模成功的30只肝硬化大鼠分為對照組和實驗組，每組各15只。對照組采用單純BMSCs移植治療，實驗組采用濟生腎氣湯聯合BMSCs移植治療。治療前及治療后1、2、3、4周檢測兩組大鼠T淋巴細胞亞群和紅細胞免疫功能指標。結果CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較，治療方法與時間存在交互作用(P＜0．05);組間比較，差異有統計學意義(P＜0．05);時間間比較，差異有統計學意義(P＜0．05)。其中，治療前和治療后1、2周對照組大鼠CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與實驗組比較，差異均無統計學意義(P＞0．05);治療后3、4周對照組大鼠CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與實驗組比較，差異均有統計學意義(P＜0．05);對照組和實驗組大鼠治療后2、3、4周CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與治療前比較，差異均有統計學意義(P＜0．05)。紅細胞C3b受體花環率(RBC·C3bRR)、紅細胞免疫復合物花環率(RBC·ICR)比較，治療方法與時間存在交互作用(P＜0．05);組間比較，差異有統計學意義(P＜0．05);時間間比較，差異有統計學意義(P＜0．05)。其中，治療前和治療后1、2周對照組大鼠RBC·C3bRR、RBC·ICR與實驗組比較，差異均無統計學意義(P＞0．05);治療后3、4周對照組大鼠RBC·C3bRR、RBC·ICR與實驗組比較，差異均有統計學意義(P＜0．05);對照組和實驗組大鼠治療后3、4周RBC·C3bRR、RBC·ICR與治療前比較，差異均有統計學意義(P＜0．05)。結論與單純BMSCs移植相比，濟生腎氣湯聯合BMSCs移植可明顯改善肝硬化大鼠的T淋巴細胞亞群和紅細胞免疫功能的相關指標。

肝硬化;間質干細胞移植;濟生腎氣湯;T淋巴細胞亞群;模型，動物

劉瑩，周曉玲，謝勝，等．濟生腎氣湯聯合骨髓間充質干細胞移植對肝硬化大鼠T淋巴細胞亞群及紅細胞免疫功能的影響研究［J］．中國全科醫學，2015，18(36):4501－4505．［www．chinagp．net］

Liu Y，Zhou XL，Xie S，et al．Effect of Jisheng Shenqi decoction combined with bone mesenchymal stem cells transplantation on T－lymphocyte subsets and red cell immune function of rats with liver cirrhosis［J］．Chinese General Practice，2015，18(36):4501－4505．

肝硬化是一種由不同病因長期作用于肝臟而引起的慢性、進行性、彌漫性肝病。肝硬化患者早期無明顯癥狀，進展至終末期則出現一系列不同程度的門靜脈高壓和肝功能障礙，直至出現上消化道出血、肝性腦病等并發癥而死亡［1］。原位肝移植是治療終末期肝病較理想的手段，但由于供體短缺、手術費用昂貴、免疫排斥及倫理道德等諸多條件的限制，難以在臨床廣泛應用。干細胞移植是近年發展起來的一種治療終末期肝病的新技術，為解決供體肝來源的短缺開拓了新的途徑。骨髓中除造血干細胞外，還有另一類間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，是源于中胚層并具有多向分化潛能的細胞，具有在不同誘導條件下向中胚層和神經外胚層組織細胞分化的能力［2－3］，研究人員還發現，MSCs在體外可分化為肝細胞樣細胞［4－6］。本課題組通過長期的臨床研究發現，聯合濟生腎氣丸能夠明顯提高骨髓MSCs(BMSCs)移植的臨床治療效果［7－8］。最新藥理研究發現，腎氣丸具有抗衰老、調節免疫及血液系統的作用，用環磷酰胺制造小鼠免疫抑制模型觀察腎氣丸對其免疫調節的作用，結果顯示，腎氣丸能提高腹腔巨噬細胞的吞噬功能，提高胸腺重量，促進淋巴細胞的轉化功能，提高紅細胞數量［9］。而肝纖維化是所有慢性肝病發展到肝硬化的必經階段，如何延緩肝纖維化過程成為治療的關鍵點。為了探討濟生腎氣湯是如何起到配合BMSCs移植發揮免疫調節作用從而減緩肝硬化的進程，本研究通過設立單純BMSCs移植的對照組與濟生腎氣湯聯合BMSCs移植的實驗組，觀察BMSCs移植治療前后兩組大鼠T淋巴細胞亞群和紅細胞免疫功能的變化，以初步闡明這一免疫調節的作用所在。

1材料與方法

1．1動物、試劑、儀器與藥物

1．1．1動物2014年10—12月選取4周齡大鼠10只，雄性，體質量(100±5)g(提取BMSCs用);健康SPF級SD大鼠37只，雄性，體質量(200±20)g(BMSCs移植用)。由廣西中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號:桂醫動字第11004號。

1．1．2試劑、儀器分離BMSCs采用低糖DMEM培養基、胎牛血清及胰蛋白酶，均購自GIBCO公司;抗大鼠CD29－PE、抗大鼠CD34－PE、抗大鼠CD45－PE、抗大鼠CD90－PE均購自美國BioLegend公司;流式細胞儀購自美國BD公司;T淋巴細胞亞群檢測采用Mouse CD4試劑盒，購自北京福瑞生物工程公司(批號:20110801);Mouse CD8試劑盒，購自西安舟鼎國生物技術有限公司(批號:20080817);紅細胞免疫功能檢測采用致敏及未致敏凍干酵母菌制劑，均購自上海第二軍醫大學長海醫院免疫室;肝硬化大鼠模型造模采用橄欖油、四氯化碳(CCl4)溶液。

1．1．3藥物濟生腎氣湯由熟地黃80 g、山茱萸40 g、山藥40 g、澤瀉30 g、茯苓30 g、丹皮30 g、肉桂10 g、附子10 g、車前子20 g、牛膝20 g構成。以上藥物由天津三延公司生產的三延牌中藥煎煮機煎煮，符合《中華人民共和國藥典(2010年版)》相關規定［10］，并由柳州市中醫院制劑室煎制。以上復方以大火煎開，文火水煎2次，過濾去渣，合并水煎液后在中藥液體包裝機中濃縮成含生藥3 g/ml溶液作為灌胃溶劑，4℃冰箱保存備用。

1．2 BMSCs分離鑒定、模型制備與給藥途徑

1．2．1大鼠BMSCs的分離培養將4周齡大鼠用異氟烷腹腔注射深度麻醉處死后，于無菌條件下分離出大鼠的股骨和脛骨，取其骨髓細胞制成單細胞懸液，用加10%胎牛血清的DMEM/F12細胞培養液接種于75 cm2的培養瓶中，置于37℃5%CO2飽和濕度的恒溫培養箱中培養，3 d后首次換液，以后每2～3 d換液1次，7～10 d細胞生長融合，經0．25%胰酶消化，1∶2傳代，其后一般3 d傳代1次，選取生長良好的P3代細胞進行實驗。之后分別加入抗大鼠CD29－PE、抗大鼠CD34－PE、抗大鼠CD45－PE、抗大鼠CD90－PE，同型對照，室溫避光孵育，應用流式細胞儀檢測BMSCs的表面標志物。

1．2．2肝硬化大鼠模型制備對健康大鼠腹腔注射50%的橄欖油CCl4溶液(橄欖油與CCl4的體積比為1∶1)，劑量1 ml/kg，1次/3 d，逐漸增加到2 ml/kg，根據大鼠體質量變化調整劑量，以體質量不增加或者輕度降低為準，注射2個月后取肝組織活檢，通過肝組織病理學證實造模成功。

1．2．3分組及給藥途徑采用隨機數字表法將造模成功的30只肝硬化大鼠分為對照組15只、實驗組15只。對照組大鼠采用單純BMSCs移植治療:經門靜脈注入1．5 ml約含1．5×106個的BMSCs。實驗組采用濟生腎氣湯中藥灌胃聯合BMSCs移植治療:經門靜脈注入1．5 ml約含1．5×106個的BMSCs;灌胃方法:在行BMSCs移植治療前后各1周，分別于每日9:00予濟生腎氣湯中藥灌胃治療，2 ml/次，2次/d，總灌胃14 d。兩組大鼠治療后均動態觀測1個月。

1．3觀察指標及測定標準

1．3．1外周血T淋巴細胞亞群CD4+、CD8

+檢測分別在治療前及治療后1、2、3、4周于大鼠尾部取血，肝素鈉抗凝，100μl全血加CD4+、CD8+抗體各10μl，輕輕吹勻后，避光，室溫溫育30 min，加1 ml紅細胞裂解液，1 000 r/min離心5 min(離心半徑140 mm)，棄上清液，用1 ml 0．001 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)重新懸浮細胞，200目過濾網過濾樣本后上機檢測，按照大鼠CD4+、CD8+試劑盒說明書，采用流式細胞儀檢測，上樣分析。從抽血采樣到分析在8 h內完成。計算CD4+/CD8+。

1．3．2紅細胞免疫功能指標檢測按常規方法操作，分別在治療前及治療后1、2、3、4周采用郭氏法［11］檢測大鼠紅細胞C3b受體花環率(RBC·C3bRR)和紅細胞免疫復合物花環率(RBC·ICR)。由于大鼠免疫細胞存在晝夜節律，故采樣時間均定于9:00。

1．4統計學方法采用SPSS 18．0統計學軟件進行數據分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間不同時間觀察指標比較采用重復測量方差分析，兩組間比較采用t檢驗，不同時間間比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1大鼠一般情況肝硬化造模過程中共死亡大鼠7只，存活30只。造模成功的肝硬化大鼠日常表現為精神差、食欲差、喜臥少動。肝硬化大鼠肝組織病理學可見假小葉形成(見圖1)。在BMSCs移植治療過程中，對照組3只大鼠因門靜脈注射BMSCs后止血不徹底而死亡;實驗組2只大鼠因移植BMSCs后發生出血不止而死亡。對照組和實驗組各有1只大鼠出現顯著的腹部膨隆，解剖腹腔發現大量清亮腹腔積液。

圖1造模成功的肝硬化大鼠肝臟病理圖片(HE染色，×100)Figure 1 Pathological picture of liver of rats with liver cirrhosis

2．2 BMSCs分離培養和鑒定結果原代培養的BMSCs多為不規則形狀，細胞核較大，此后貼壁生長的細胞呈集落樣生長，懸浮的細胞隨著換液逐漸被去掉，生長良好的P3代細胞呈梭狀，且細胞形態更趨于一致(見圖2)。流式細胞儀檢測表面抗原特性，結果顯示，CD34、CD45陽性率分別為0．38%、0．62%，CD29、CD90陽性率分別為97．3%、98．5%，說明傳代貼壁生長的梭形細胞是骨髓中區別于造血干細胞的另一群處于未分化狀態的非定向干細胞——BMSCs。

圖2生長良好的P3代細胞呈形態一致的梭狀Figure 2 P3'cells in well growth taking on fusiform in a consistent pattern

2．3兩組大鼠治療前后外周血T淋巴細胞亞群檢測結果比較CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較，治療方法與時間存在交互作用，差異有統計學意義(P＜0．05);組間比較，差異有統計學意義(P＜0．05);時間間比較，差異有統計學意義(P＜0．05)。其中，治療前和治療后1、2周對照組大鼠CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與實驗組比較，差異均無統計學意義(P＞0．05);治療后3、4周對照組大鼠CD+、CD+、CD+484/CD8+與實驗組比較，差異均有統計學意義(P＜0．05);對照組和實驗組大鼠治療后2、3、4周CD+、CD+、CD+484/CD8+與治療前比較，差異均有統計學意義(P＜0．05，見表1)。

2．4兩組大鼠治療前后外周血紅細胞免疫功能指標比較RBC·C3bRR、RBC·ICR比較，治療方法與時間存在交互作用，差異有統計學意義(P＜0．05);組間比較，差異有統計學意義(P＜0．05);時間間比較，差異有統計學意義(P＜0．05)。其中，治療前和治療后1、2周對照組大鼠RBC·C3bRR、RBC·ICR與實驗組比較，差異均無統計學意義(P＞0．05);治療后3、4周對照組大鼠RBC·C3bRR、RBC·ICR與實驗組比較，差異均有統計學意義(P＜0．05);對照組和實驗組大鼠治療后3、4周RBC·C3bRR、RBC·ICR與治療前比較，差異均有統計學意義(P＜0．05，見表2)。

3討論

本研究通過對濟生腎氣湯聯合BMSCs移植治療肝硬化大鼠進行研究，觀察治療前后大鼠的T淋巴細胞亞群和紅細胞免疫功能指標的變化，發現治療后大鼠的CD+、CD+、CD+484/CD8+、RBC·C3bRR明顯增高、RBC·ICR明顯下降。眾所周知，T淋巴細胞亞群在肝細胞損害、機體抗腫瘤免疫中起重要作用，其是最為活躍的免疫活性細胞之一，不僅是細胞免疫的效應細胞，還有調節細胞免疫的作用。CD4+T淋巴細胞主要由Th細胞構成，其功能可協助T、B淋巴細胞產生免疫應答。而CD8+T淋巴細胞主要由細胞毒性T淋巴細胞和Ts細胞構成，其不僅對B細胞合成和分泌抗體有抑制作用，而且對Th輔助作用、遲發型超敏反應以及Tc介導的細胞毒作用均可起到負調節作用［10］。

表1兩組大鼠治療前后外周血T淋巴細胞亞群檢測結果比較(x±s)Table 1 Comparison of T cell subset in the peripheral blood between the two groups before and after treatment

表2兩組大鼠治療前后外周血紅細胞免疫功能指標比較(x±s，%)Table 2 Comparison of red blood cell immune function of peripheral blood between the two groups before and after treatment

從1981年Siegel等［11］提出紅細胞具有免疫功能的理論后，該理論受到人們的重視，并被廣泛應用于臨床治療的療效評價體系中。紅細胞不僅具有呼吸功能，而且還參與機體的免疫防御機制。由于紅細胞數量多，其作用是白細胞無法比擬的，具有識別濃縮抗原、增強淋巴細胞免疫功能的作用，還可利用紅細胞膜上的C3b受體轉運銷毀循環免疫復合物。紅細胞與細菌、病毒等微生物黏附后，可以通過釋放細胞內的過氧化物酶直接殺傷微生物，并且促進吞噬細胞的吞噬作用。此外，紅細胞不僅自身具備完整的自我調控系統，還參與調控機體的整體免疫功能，從而發揮其在機體固有免疫應答中的重要作用。當肝細胞遭到嚴重破壞時，肝臟合成功能減退，紅細胞免疫功能受損，其表現以RBC·C3bRR降低和RBC·ICR增高為主［12］;另一方面，由于肝內巨噬細胞吞噬功能障礙，使紅細胞CRI攜帶CIC卸下轉運至巨噬細胞銷毀能力減弱。肝細胞壞死、再生和肝纖維化造成脾臟淤血，網狀內皮系統處于異常狀態，清除、滅活CIC能力進一步減弱。對肝硬化大鼠的研究中，雖然肝硬化大鼠是人為藥物所致，與人體長期感染病毒所致的肝炎后肝硬化不同，但均為肝細胞遭到大面積破壞，進而促使肝臟合成功能減退，這在一定程度上必然影響整個大鼠機體免疫功能的紊亂。本研究肝硬化大鼠雖未經過炎癥的反復作用，但其肝功能在短期內遭到破壞致使其免疫功能紊亂，這與整個肝臟參與整個機體的運作是密切相關的。本研究發現，BMSCs移植治療肝硬化大鼠，治療后RBC·C3bRR升高而RBC·ICR降低，說明BMSCs移植后肝硬化大鼠紅細胞調節免疫的功能得到了一定的恢復，有可能是移植后的干細胞在紅細胞免疫重建中發揮了作用。

本研究還發現，濟生腎氣湯聯合BMSCs移植可進一步提高治療效果。近年來，中醫藥在治療肝纖維化與肝硬化上已取得了一定的進展，已有多個抗肝纖維化經驗方藥與中藥新藥問世并廣泛用于臨床，其共同闡明“正虛血瘀”為肝硬化之病機特點，而“扶正化瘀”則成為了中醫藥治療肝纖維化、肝硬化的基本治則［13］。正氣虧耗為久病肝硬化患者的共同特點，其病以“正虛”為本，且多以脾腎兩虛為主。本課題組前期研究中發現，濟生腎氣湯可能增強了干擾素α－2b治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者的免疫應答，并減少了干擾素α－2b治療的不良反應［14］。劉靜生等［15］采用益腎升白湯方治療肝腎陰虛型失代償性肝硬化，以扶正祛邪為原則，調補肝腎為治法，獲得較好療效。本研究采用的濟生腎氣湯是漢代醫圣張仲景創制的著名方劑，該方具有填精益髓、溫陽利水功能，已被廣泛應用于臨床。縱觀全方，以小劑溫陽藥置于10倍之滋陰利水劑之中，恰似坎卦一陽爻藏于兩陰爻之中，取象于火涵水中，藏而不露。又以山藥厚其土以藏之，山茱萸斂其氣以秘之，澤瀉、丹皮、茯苓引亢火以歸之，車前子、牛膝以消陰翳。如此則腎復其封蟄之職，水中之火，不亢不衰，緩緩蒸騰，溫養五臟六腑，而不蓄水。該方配伍充分體現了水火既濟之象，這一全新配伍從中醫上增強溫補脾腎助陽利水之效，臨床上用于久病肝硬化患者，以少量腹腔積液多見，此方在溫補腎陽的同時起到化濕之功效。本研究結果亦表明，濟生腎氣湯聯合BMSCs移植治療肝硬化大鼠，不僅其外周血T淋巴細胞亞群指標得到改善，紅細胞免疫功能指標亦得到顯著改善。這表明濟生腎氣湯具有優異的免疫調控功能，與BMSCs移植聯合運用可起到免疫功能協同增效的作用，可能對BMSCs移植后的定植及增強細胞活性起到積極的調控作用。

綜上所述，筆者通過相關檢索發現，目前對BMSCs移植治療肝硬化的具體作用機制尚未完全明確［16－17］，在免疫相關性研究上，雖然紅細胞免疫理論近年研究呈減少趨勢，但其在肝硬化機體中的免疫功能作用是不能忽略的，本研究以外周血T淋巴細胞亞群及紅細胞免疫功能指標變化作為出發點，旨在初步闡明肝硬化大鼠相關免疫功能的變化。而聯合中醫藥的治療方案及相關機制的研究則更是罕見，本研究通過建立肝硬化大鼠模型，觀察兩種方案在改善大鼠外周血T淋巴細胞亞群和紅細胞免疫功能指標上的不同，發現濟生腎氣湯聯合BMSCs移植的治療效果優于單純BMSCs移植，且其療效指標也比對照組要穩定，從而初步闡明了濟生腎氣湯聯合BMSCs移植治療方案的作用機制之所在，為該療法的臨床推廣應用提供了一定的理論基礎。但同時，本研究對濟生腎氣湯聯合BMSCs移植的具體協同機制和免疫調節機制仍存在諸多不明確性，這需要在后續的研究中進一步揭示，從而為肝硬化患者能獲得更好、更有效的治療提供新思路、新方法。

利益沖突聲明:本課題未涉及任何廠家及相關雇主或其他經濟組織直接或間接的經濟或利益的贊助。無利益沖突。

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Effect of Jisheng Shenqi Decoction Combined W ith Bone M esenchym al Stem Cells Transp lantation on T－lym phocyte Subsets and Red Cell Immune Function of Rats W ith Liver Cirrhosis

LIU Ying，ZHOU Xiao－ling，XIE Sheng，et al．Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China

ObjectiveTo investigate the influence of Jisheng Shenqidecoction combined with bonemesenchymal stem cells(BMSCs)transplantation on T－lymphocyte subsets and red cell immune function of rats with liver cirrhosis．Methods From October to December in 2014，liver cirrhosismode was successfully built in 30 rats，and the ratswere divided into control group and trial group using convenience number table method with 15 in each group．Control group was administrated with only BMSCs transplantation，and trial group was administrated with Jisheng Shenqi decoction combined with BMSCs transplantation．Before treatmentand 1，2，3 and 4 weeks after treatment，the T－lymphocyte subsets and red blood cell immune function of the rats were measured．Results In the comparison of CD4+，CD8+and CD4+/CD8+，interaction effect existed between treatmentmethod and time(P＜0．05);significant differences existed between the two groups(P＜0．05);significant differences existed between different time points(P＜0．05)．Before treatment，1 week and 2 weeks after treatment，control group were not significantly different(P＞0．05)from trial group in CD4+，CD8+and CD4+/CD8+;3 weeks and 4 weeks after treatment，control group and trial group were significantly different(P＜0．05)in CD4+，CD8+and CD4+/CD8+;the CD4+，CD8+and CD4+/CD8+of control group and trial group at 2 weeks，3 weeks and 4 weeks after treatment were significantly different from those before treatment(P＜0．05)．In the comparison of RBC·C3bRR and RBC·ICR，interaction effectexisted between treatmentmethod and time(P＜0．05);significant differences existed between the two groups(P＜0．05);significant differences existed between different time points(P＜0．05)．Before treatment，1 week and 2 weeks after treatment，control group were not significantly different(P＞0．05)from trial group in RBC·C3bRR and RBC·ICR;3 weeks and 4 weeks after treatment，control group and trial group were significantly different in RBC·C3bRR and RBC·ICR(P＜0．05)．Conclusion

Compared with the only use of BMSCs transplantation，BMSCs transplantation combined with Jisheng Shenqi decoction can significantly improve the T－lymphocyte subsets and red blood cell immune function of rats with liver cirrhosis．

Liver cirrhosis;Mesenchymal stem cell transplantation;Jisheng Shenqi decoction;T－lymphocyte subsets;Models，animal

R 657．31

A

10．3969/j．issn．1007－9572．2015．36．021

2015－03－24;

2015－10－09)

(本文編輯:陳素芳)

廣西科學研究與技術開發計劃項目課題(桂科攻1298003－2－10)

530001廣西南寧市，廣西中醫藥大學研究生學院(劉瑩);柳州市中醫院(周曉玲，侯秋科，李澤鵬，陳峭，李燦，韋金秀);廣西中醫藥大學第一附屬醫院(謝勝)

周曉玲，545001廣西柳州市中醫院;E－mail:zxl_lz@163．com