固定化微生物對石油污染土壤生物學特性的影響

張秀霞，張守娟，張 涵，韓雨彤，郭云霞

(中國石油大學 環境與安全工程系，山東 青島266580)

固定化微生物對石油污染土壤生物學特性的影響

張秀霞，張守娟，張 涵，韓雨彤，郭云霞

(中國石油大學 環境與安全工程系，山東 青島266580)

在固定化微生物對石油污染土壤修復35 d的過程中，考察了土壤脫氫酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶、脲酶活性及細菌數量幾種生物學特性的變化規律，進一步分析其石油烴降解率變化與酶活性、細菌數量之間的相關性，并以添加游離菌、秸稈及土著菌的土壤對照。結果表明，固定化微生物修復石油污染土壤的各個階段，細菌數量、酶活性均高于對照組，石油烴降解效果最好，降解率高達40.8%；土壤的脲酶活性與其石油烴降解率的相關性最顯著，相關性系數為0.994，可以作為固定化微生物降解石油污染土壤效果的指標。

固定化微生物；生物學特性；相關性；降解率

隨著石油化工工業的發展，在勘探、開采、運輸及儲存過程中，油田周圍大面積的土壤受到石油的污染，石油混合物已經成為土壤中主要污染物[1]。石油污染導致土壤的通透性降低，土壤的營養結構失調，嚴重影響土壤的肥力[2]，還嚴重影響土壤的酶活性，使土壤微生物數量降低，導致新陳代謝緩慢[3]。所以石油污染土壤的治理是國內外研究的熱點。

近年來很多學者研究表明，高等植物、指示微生物、蚯蚓、土壤酶等可以用來評價和監測污染土壤修復過程[4-6]。其中，土壤酶是一種生物催化劑，可有效地促進土壤中的有機污染物降解[7-8]，成為石油污染土壤生態系統的中心。

筆者從土壤生物學特性角度出發，考察固定化微生物在修復過程中土壤脫氫酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶、脲酶活性和細菌數量與石油烴降解率的變化規律，然后使用SPSS18.0軟件對石油烴降解率變化與生物學特性進行相關性分析，揭示固定化微生物高效降解石油烴的原因，為實際應用提供理論指導。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

石油污染土樣取自新疆風城油田作業區附近被石油污染的土壤，風干，碾碎，裝瓶置于4℃冰箱備用。菌種來自大慶油田、新疆風城作業區等15個石油污染土壤，經過層層篩選馴化培養，選取石油烴降解率最高的菌株作為后續固定化對象，培養基中原油降解率為51.7%。

1.2 實驗方法

1.2.1 土壤理化性質

采用超聲萃取-紫外分光光度法[9]測定得到供試土樣石油烴質量分數平均為4.72%；采用重量法測得供試土樣含水率在8.58%～8.86%范圍；采用pH S-3酸度計電位法測得土樣的pH值為7.2；采用重鉻酸鉀容量法測得土樣的有機質質量分數在47.12～51.84 g/kg范圍；采用半微量凱氏法測定土壤的全氮質量分數為0.145～0.161g/kg；采用鉬銻抗比色法測定土壤的速效磷質量分數為2.911～3.231×10-3g/kg[10]。

調節土壤的有機質含量與全氮、速效磷的質量比m(C)∶m(N)∶m(P)=100∶10∶1。土壤的含水率保持在18%左右。

1.2.2 土壤生物學特性測定

采用比色法(波長為485 nm)測定土壤脫氫酶活性，每1 g干土6 h生成的TPF為脫氫酶的一個活性單位；采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性，單位為0.1 KMnO4/(h·g)；采用比色法(波長為578 nm)測定脲酶活性，以24 h后1 g土壤中含NH3-N的mg數表示；采用比色法(波長為430 nm)測定多酚氧化酶活性，以2 h后每1 g土的紫色沒食子酸的mg數表示[11]，采用稀釋平板計數法測定土壤的細菌量。測得的土壤脫氫酶、過氧化氫酶活性及細菌數量分別為0.0049 mg/(g·6h)、0.16 mL(0.1 KMnO4)/(h·g)、7.56×107個/g，脲酶、多酚氧化酶活性均未檢出。

1.2.3 固定化微生物制備及生物量測定

以實驗室前期篩選出來吸菌量較大、降油率較高的秸稈DG作為載體，將其粉碎后篩分至40目，采用吸附法制備固定化微生物。采用稀釋平板計數法測定生物量[12]，計算1 mL游離菌菌液與1 g固定化微生物的細菌數量之間的關系，得到1 g固定化微生物相當于8.58 mL游離菌菌液。使用牛肉膏蛋白胨為細菌培養基[13]。

1.2.4 微生物修復石油污染土壤花盆模擬實驗

4個花盆中各盛500 g供試土樣，然后在其中3個花盆分別添加按100 g土樣加10 mL比例的活化的游離菌菌液、同等生物量的固定化微生物、5.83 g滅菌秸稈，最后1個花盆不添加任何微生物。將這4個花盆置于30℃恒溫培養箱中進行35 d室內土壤修復實驗。每1 d翻耕澆水，以保證微生物充足的氧氣和水分，每隔7 d分別測定它們的脫氫酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶、脲酶活性，細菌數量及石油烴質量分數。采樣前，將土壤翻耕均勻，以四分法分樣，取3個平行樣，以平均值計為結果，并研究石油烴降解率與酶活性的相關性。

2 結果與討論

2.1 微生物修復石油污染土壤時石油烴降解率的變化

秸稈、游離菌、固定化微生物、土著菌35 d修復石油污染土壤過程中石油烴降解率的變化如圖1所示。由圖1可見，固定化微生物修復35 d，石油烴降解率達到40.8%，高于秸稈、游離菌、土著菌3個對照組，它們的石油烴降解率分別為18.6%、21.7%、6.9%。固定化微生物和游離菌在修復的前14 d石油烴降解率增加緩慢，14～28 d時效果明顯增加，游離菌修復的土壤降解率一直比較低，而且降解緩慢，35 d時二者均達到最高值。秸稈對石油烴的降解有一定的效果，因為秸稈能為土著菌提供一定的營養物質，提高土壤中酶活性，進而降解石油烴。由于石油烴的揮發及土著菌的降解，只含土著菌的石油污染土壤也有一定的降解率。

圖1 不同微生物修復石油污染土壤的石油烴降解率隨時間的變化

2.2 固定化微生物對土壤生物特性影響

2.2.1 對脫氫酶活性的影響

微生物對石油烴的降解或轉化從脫氫開始，起著氫的中間轉化傳遞作用，因此可以利用脫氫酶活性作為評價微生物降解石油烴能力的指標。微生物對石油污染土壤35 d修復過程中脫氫酶活性的變化如圖2所示。由圖2可見，無論固定化微生物、游離菌還是秸稈都能使土壤脫氫酶活性逐漸增強，其中固定化微生物修復土壤的脫氫酶活性增加幅度最大，從0.0049 mg/(g·6h)增至0.1840 mg/(g·6h)，游離菌略小，增至0.1570 mg/(g·6h)。王旭輝等[14]研究表明，脫氫酶活性與石油烴降解率變化趨勢基本相同。固定化微生物的石油烴降解率一直處在較高的水平(見圖1)，在修復初期，由于微生物不適應新環境，不能分泌大量的土壤酶，導致脫氫酶活性變化不明顯；修復7～21d，脫氫酶活性增加迅速，說明土壤微生物新陳代謝增強，脫氫酶大量分泌；21 d后各種修復方式的脫氫酶活性增加緩慢，可能是由于降解石油烴過程中產生了難降解物質積累以及有毒代謝產物增加，抑制酶活性增強。秸稈處理的土壤的脫氫酶活性也增加，添加秸稈能夠改善土壤理化性質，提高土壤肥力[15]，刺激脫氫酶的分泌。

2.2.2 對過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶能促進H2O2分解生成O2和H2O，防止H2O2對生物體的毒害[16]。石油污染土壤35 d修復過程中過氧化氫酶活性變化如圖3所示。由圖3可見，在修復過程中，過氧化氫酶活性均呈現先增大后減小的趨勢。添加游離菌、秸稈及固定化微生物都能夠增加土壤微生物密度，微生物的呼吸作用增加微生物對土壤中H2O2的分解，促進了過氧化氫酶的分泌，導致酶活性增大。其中，固定化微生物和游離菌修復初期，過氧化氫酶的活性相近，分別為0.153 mL(0.1KMnO4)/(h·g)和0.150 mL(0.1KMnO4)/(h·g)；修復14 d后，固定化微生物修復的土壤中過氧化氫酶活性明顯增加；土壤修復21d后，過氧化氫酶活性稍有降低后幾乎不再變化，是由于石油烴分解后產生有毒物質積累抑制了酶活性的分泌[17]。由于過氧化氫酶活性與微生物呼吸量顯著相關[18]，游離菌和秸稈修復28 d后，土壤中微生物數量少，呼吸作用弱，過氧化氫酶活性小幅度減小。固定化微生物、游離菌、秸稈、土著菌修復土壤35 d，過氧化氫酶活性分別為0.60、0.53、0.49、0.26 mL(0.1KMnO4)/(h·g)。固定化微生物修復的土壤過氧化氫酶活性顯著增加，為高效降解石油烴提供依據。

圖2 微生物修復石油污染土壤過程中脫氫酶活性的變化

圖3 微生物修復石油污染土壤過程中過氧化氫酶活性的變化

2.2.3 對多酚氧化酶活性的影響

多酚氧化酶能將土壤芳香族化合物氧化成醌，醌與土壤中蛋白質、氨基酸、糖類、礦物等物質反應生成大小分子質量不等有機質和色素，完成土壤芳香族化合物循環，促進土壤有機碳的累積，改善土壤物理性狀[19]。土壤中多酚氧化酶是一類具有重要功能的酶，與土壤酚類物質的含量呈正比，在污染土壤石油烴的降解過程中不斷產生酚類物質來促進微生物形成多酚氧化酶，提高了多酚氧化酶活性。

石油污染土壤35 d修復過程中多酚氧化酶活性變化如圖4所示。由圖4可見，4種微生物修復石油污染土壤過程中多酚氧化酶酶活性有不同程度的增大。前期的實驗證明，土壤有機質、全氮、速效磷含量在修復過程中逐漸降低，與劉清秀等[20]研究多酚氧化酶活性與土壤的有機質、全氮、速效磷呈負相關的結果一致。固定化微生物35 d修復石油污染土壤過程中，多酚氧化酶活性變幅最大，從起初未檢出增至10.01 mg/(g·2h)；秸稈修復過程中多酚氧化酶活性增至8.55 mg/(g·2h)；而游離菌和土著菌修復時，多酚氧化酶分別提高到5.52 mg/(g·2h)和0.71 mg/(g·2h)。相比而言，固定化微生物和秸稈在土壤修復過程中對多酚氧化酶活性的增強效果最好，這是由于秸稈的加入有利于土壤微生物對多酚氧化酶的分泌[15]。

圖4 微生物修復石油污染土壤過程中多酚氧化酶活性的變化

2.2.4 對脲酶活性的影響

脲酶是一種酰胺酶，可促進有機物質中碳氮鍵(CO—NH)的水解，對土壤氮素循環發揮著重要作用；其活性的提高有利于土壤中穩定性較高的有機氮向有效氮的轉化，從而改善氮素供應狀況，在石油污染土壤生物修復中可反映土壤氮素轉化狀況及營養水平[21]。

石油污染土壤35 d修復過程中脲酶活性的變化如圖5所示。由圖5可見，土壤中脲酶活性隨修復時間的延長而增加，固定化微生物修復土壤的脲酶活性始終高于對照組，游離菌的略高于秸稈的。在石油污染土壤修復35 d內，固定化微生物修復土壤的脲酶活性從起初的0增至0.29 mg/(g·h)。土壤修復初期脲酶活性變化緩慢，7 d后快速升高，表明土壤中添加的微生物大量繁殖，促進土壤氮素的轉化活躍，促進了脲酶的分泌；21 d后營養物質大量消耗，易降解組分的減少，多環芳烴(PAHs)含量的相對增加，導致脲酶活性變化緩慢。邱莉萍等[22]提出，脲酶活性與土壤肥力有顯著相關性，秸稈的加入改善了土壤的營養結構，所以秸稈修復的土壤脲酶活性也有所增加。

圖5 微生物修復石油污染土壤過程中脲酶活性的變化

2.2.5 土壤細菌量的變化

石油污染土壤35 d修復過程中細菌量的變化如圖6所示。由圖6可見，在幾種修復方式修復過程中，細菌數量呈先增大后變化平緩或降低的趨勢，但數量上升的幅度不同；固定化微生物修復的土壤細菌數量增大最多，從1.29×108增至1.62×1011，其次是游離菌修復，細菌數量增至3.98×1010，表明固定化微生物和游離菌的加入提高了土壤細菌量，為石油烴的降解提供了動力。在修復初期，降解菌不適應土壤環境，細菌量變化不大，隨著修復時間的延長，細菌以石油烴為碳源，不斷繁殖，細菌量迅速增多。這一現象在固定化微生物修復土壤的過程中較為明顯，一方面是因為，固定化秸稈材料利用其多孔特性將細菌吸附在內孔里，提高了微生物密度[23]，減少外界干擾；另一方面是因為，秸稈能夠分散油類，將油類吸附在秸稈表面上[24]，提供給秸稈上的石油降解菌養分，細菌數量增多，石油烴降解率隨之提高。在修復末期細菌數量變化不大或者降低，是因為在降解石油烴的過程中產生的中間產物對細胞有毒害作用。

圖6 微生物修復石油污染土壤過程中細菌量的變化

2.3 土壤生物學特性與石油烴降解率的相關性

通過SPSS18.0分析了固定化微生物、游離菌對污染土壤石油烴降解率與土壤生物學特性的相關性，結果列于表1。由表1可見，土壤生物學特性，即脲酶、脫氫酶、多酚氧化酶、細菌量、過氧化氫酶活性與固定化微生物、游離菌修復時的石油烴降解率相關性依次降低；脲酶活性與固定化微生物、游離菌的石油降解率的相關性最高，相關系數分別為0.994、0.981，所以脲酶活性可以作為石油烴生物降解情況的重要指標，與Li等[25]的研究結果一致。細菌量與石油烴降解率的相關性并不高，可能由于細菌量在一定程度上并非準確反映土壤微生物活性[26]，酶活性能夠直觀反映石油烴降解菌的活性，所以其作為土壤石油烴降解率的指標更具有說服力。

表1 固定化微生物和游離菌的石油烴降解率與土壤生物學特性的相關性

1) Correlation is significant at the 0.01 level (1-tailed); 2) Correlation is significant at the 0.05 level (1-tailed)

3 結 論

(1)固定化微生物修復石油污染土壤35 d的過程中，土壤中細菌數量增幅最大，且各種酶的分泌能力強于其他修復方式，石油烴降解率最高達到40.8%，高出游離菌的約20%。

(2)固定化微生物對土壤中的各種生物酶的分泌有較強的促進作用，修復35 d后脫氫酶活性從0.0049增至0.184 mg/(g·6h)，過氧化氫酶活性從0.15增至0.60 mL(0.1KMnO4)/(h·g)，多酚氧化酶活性從0增至10.01 mg/(g·2h)，脲酶活性從0增至0.29 mg/(g·h)，從而加強了對石油烴的降解。

(3)石油污染土壤石油烴降解率與其生物學特性具有顯著相關性。固定化微生物、游離菌修復石油污染土壤的石油烴降解率與脲酶活性存在極顯著相關性，相關性系數分別達到0.994、0.981，與細菌量的相關系數分別達到0.901、0.893。土壤中的脲酶活性更能準確反映土壤中石油烴的降解狀況。

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Influence of Immobilized Microorganism on Biological Characteristics of Petroleum-Contaminated Soil

ZHANG Xiuxia， ZHANG Shoujuan， ZHANG Han， HAN Yutong， GUO Yunxia

(DepartmentofEnvironmentalandSafetyEngineering，ChinaUniversityofPetroleum，Qingdao266580，China)

In the process of 35 d remediation of petroleum-contaminated soil by immobilized microorganism， the changes of dehydrogenase， catalase， polyphenol oxidase， urease activity and bacteria number in the soil were investigated with the free bacteria， straw， native bacteria as the control group. Further， the correlations of hydrocarbon degradation rate with soil enzyme activities and bacteria number were analyzed. The results showed that at each stage of petroleum-contaminated soil remediation by immobilized microorganism， soil bacteria number and enzymatic activity were higher than that by the control group， so the hydrocarbon degradation rate could reach 40.8%. The correlation between hydrocarbon degradation rate and urease activity was significant， with the correlation coefficient of 0.994， thus urease activity could be the indicator for hydrocarbon degradation efficiency in petroleum-contaminated soil remediation by immobilized microorganism.

immobilized microorganism; biological characteristics; correlation; degradation rate

2013-10-28

山東省自然科學基金(ZR2014BM023)、中國石油科技創新基金(2009D-5006-07-01)、青島市科技發展指導計劃項目(KJZD-12-65-jch)、中央直屬高?？蒲袑ｍ椈?11CX05011A)、中國石油大學(華東)研究生創新工程項目(CX-1219和CX2013035)資助

張秀霞，女，教授，博士，從事石油污染土壤修復研究；E-mail zhxiuxia@upc.edu.cn

1001-8719(2015)01-0112-07

X53

A

10.3969/j.issn.1001-8719.2015.01.018