尿毒癥毒素對甲酚對單核細胞體外釋放炎癥因子的影響

丁瑜，王健，梁新，韋杏雪，鄒仲敏，袁發煥

尿毒癥毒素對甲酚對單核細胞體外釋放炎癥因子的影響

丁瑜，王健，梁新，韋杏雪，鄒仲敏，袁發煥

目的利用體外細胞模型研究尿毒癥毒素對甲酚對單核細胞釋放炎癥因子的影響及其可能機制。方法采用CCK-8法檢測THP-1單核細胞株經20、40、80、160mg/L對甲酚分別處理6、12、24h后細胞增殖能力的變化；根據細胞增殖實驗結果，選取40mg/L和80mg/L兩個劑量組作為低劑量組和高劑量組，提取細胞RNA和蛋白質，用RT-PCR法、Western blotting檢測對甲酚處理24h后THP-1單核細胞株炎癥因子TNF-α、抗炎因子IL-10以及炎癥相關Toll樣受體4(TLR-4)mRNA和蛋白表達的變化。結果對甲酚可抑制THP-1細胞增殖，其抑制作用呈濃度和時間依賴性(P<0.05)；RT-PCR及Western blotting檢測顯示，對甲酚處理的THP-1細胞炎癥因子TNF-α釋放增加，IL-10釋放減少，TLR-4表達增加(P<0.05)。結論對甲酚可抑制THP-1細胞增殖，抑制IL-10抑炎因子表達，并可能通過上調TLR-4的表達，促進促炎因子TNF-α的釋放，從而導致微炎癥狀態。

單核細胞；尿毒癥；細胞因子類；對甲酚

慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)是常見的腎臟疾病，患病率高達8%～10%，且晚期并發癥多，病死率高。CKD患者中約70%死于心血管疾病(50%)和感染(20%)，兩者都與慢性腎病終末期的微炎癥狀態相關。微炎癥狀態是指機體在各種補體、免疫復合物、內毒素等非微生物因素刺激下，以單核巨噬細胞激活和促炎因子釋放為中心的炎癥反應，表現為全身循環中炎癥標志蛋白及炎性細胞因子持續升高[1]。研究顯示，腫瘤壞死因子α(TNF-α)等對微炎癥狀態敏感的炎癥因子具有促進腎纖維化及促進動脈粥樣硬化等作用[2-5]。在終末期慢性腎病患者中，腎功能減退導致體內大量尿毒癥毒素蓄積。尿毒癥毒素依據其生化性質以及清除方式可分水溶性物質、不與蛋白質結合的小分子物質、中分子物質以及蛋白結合毒素，其中蛋白結合毒素如硫酸吲哚酚(indoxyl sufate，IS)、硫酸對甲酚(P-cresylsuifate，PCS)可以競爭性地與血漿蛋白結合。由于蛋白結合毒素可附著于血漿蛋白，所以難以通過常規透析進行清除。研究表明，此類毒素可導致內皮細胞、腎小管上皮細胞凋亡增加，炎性細胞因子釋放增多[6-7]，同時還能刺激免疫系統，促進白細胞募集[8]，降低T細胞Th1/Th2比率。但蛋白結合毒素對尿毒癥患者微炎癥狀態的作用及其機制尚不清楚。本研究以體外單核細胞為模型，觀察蛋白結合毒素對甲酚(p-cresol，PC)對細胞炎癥因子釋放的影響，并初步探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人單核細胞株THP-1為本室保存。對甲酚購自美國Sigma公司；RPMI 1640細胞培養基及胎牛血清購自HycClone公司；Cell Counting Kit(CCK-8)試劑盒購自日本同仁化工；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；2×TaqMaster Mix購自Novoprotein公司，引物為自行設計，由英濰捷基合成；反轉錄反應和PCR擴增均在Bio-Rad公司的S1000型PCR儀上進行；兔抗人TNF-α、白介素10(IL-10)、Toll樣受體4(TLR-4)抗體購自武漢博士德公司；BCA蛋白定量試劑盒、PMSF、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、彩色預染蛋白分子量標準、小鼠抗人β-actin抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、ECL發光液等購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 單核細胞培養及對甲酚溶液配制 單核細胞THP-1用含10%胎牛血清的完全培養基RPMI 1640在37℃、5% CO2孵箱中培養，2d換液1次。對甲酚溶液配制：取對甲酚凍干粉，用滅菌PBS溶解稀釋，參考文獻[9]中CKD患者的血清對甲酚水平，先配制成1600mg/L母液，再依次稀釋配制成20、40、80、160mg/L濃度對甲酚工作液處理細胞，現用現配。

1.2.2 CCK-8檢測對甲酚對THP-1細胞活性的影響

收集對數期THP-1細胞，1×105個/孔接種于96孔板，100μl完全培養基培養過夜。按20、40、80、160mg/L劑量分組加入不同濃度對甲酚，另設加入等量PBS的空白對照組，每組設6個平行孔(100μl/孔)。培養6、12、24h后，加入CCK-8試劑10μl，37℃繼續培養1.5h后在酶標儀上于450mm波長處檢測每孔的吸光度(A)值。以空白對照組A450值均數為對照，以平行孔的平均A450值作為各實驗組的A450值。細胞增殖水平=實驗組A450/對照組A450×100%。根據CCK-8實驗結果，選取細胞增殖在正常水平80%和60%實驗組的劑量為后續實驗的劑量。

1.2.3 RT-PCR法檢測THP-1細胞TLR-4、IL-10、TNF-α mRNA的表達 THP-1細胞培養24h后分為40、80mg/L對甲酚處理組及空白對照組(加入同體積PBS)繼續培養24h，收集細胞，PBS洗滌3次，加入500μl Trizol裂解細胞，Trizol法常規提取細胞RNA；檢測各組RNA質量和濃度。所用引物序列如下：TNF-α上游5'-AGGCGGTGCTTGTTCCTCA-3'，下游5'-GTTCGAGAAGATGATCTGACTGCC-3'，擴增產物長度167bp；IL-10上游5'-AGGGCACCCAGTCTGAGA ACA-3'，下游5'-CGGCCTTGCTCTTGTTTTCAC-3'，擴增產物長度351bp；TLR-4上游5'-AGAAATGAA GGAAACTTGGAAAAGT-3'，下游5'-TTGGAATGC TGGAAATCCAGATGTT-3'，擴增產物長度509bp；β-actin上游5'-GGCACCACCATGTACCCTG-3'，下游5'-CACGGAGTACTTGCGCTCAG-3'，擴增產物長度114bp。按TaKaRa公司反轉錄試劑盒說明書將提取的RNA反轉錄為cDNA(反應體系10μl)。梯度退火溫度摸索3種引物及內參最佳退火溫度，IL-10、TNF-α及TLR-4最佳退火溫度分別為59℃、55℃、55℃，β-actin退火溫度為60℃。反應條件為：94℃5min；94℃ 1min，退火溫度30s，72℃ 1min，35個循環；72℃ 10min。瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，電泳結果采用Image J軟件進行灰度值分析。以各目的基因灰度值與內參灰度值的比值為其相對表達量。實驗重復3次。

1.2.4 Western blotting檢測THP-1細胞TLR-4、IL-10、TNF-α蛋白的表達 用對甲酚按前述方法處理各組細胞后，PBS洗3次，收集細胞。每組細胞中加入200μl蛋白裂解液(RIPA:PMSF按100:1配制)，14 000×g離心5min，取上清。BCA蛋白定量試劑盒定量，調整蛋白電泳上樣量。蛋白樣品按照4:1比例加入5×Loading Buff，混勻，沸水浴變性5min。12%分離膠進行蛋白電泳，18V電壓半干法轉膜，5%脫脂奶粉封閉1h后，加1:1000稀釋的一抗4℃孵育過夜。次日TBST洗膜3次，每次15min，二抗1:1000稀釋，室溫孵育1h；TBST洗膜3次，每次10min；TBS洗膜1次，5min。采用ECL發光液顯色，FX成像系統曝光。Image J軟件分析面積灰度值。實驗重復3次。

1.3 統計學處理 采用SPSS 10.0軟件進行統計學分析。計量資料數據以表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Scheffe檢驗(方差齊時)或采用TamhaneT2檢驗(方差不齊時)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 對甲酚對THP-1細胞增殖的影響 CCK-8檢測結果顯示，對甲酚處理6h后，20、40、80、160mg/L濃度組的細胞活力分別下降至正常對照組的88.18%±7.81%、87.94%±5.66%、76.03%±4.55%、67.25%±8.48%，其中80、160mg/L組細胞抑制作用明顯(P<0.05)。對甲酚處理12、24h后，各組細胞活力均較正常對照組有不同程度的下降，其中80、160mg/L組與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。另一方面，各劑量對甲酚處理組的細胞活力隨著藥物處理時間的延長而不斷下降，但差異無統計學意義。其余各濃度對甲酚處理組的細胞均有相似變化。最終我們選取40mg/L和80mg/L兩個濃度作為低劑量處理組和高劑量處理組進行后續實驗，對甲酚處理時間確定為24h(表1)。

2.2 對甲酚對THP-1細胞中TNF-α、IL-10、TLR-4 mRNA表達的影響 對甲酚處理后，細胞TNF-α、TLR-4 mRNA表達水平升高，IL-10 mRNA表達水平降低，其中高劑量組與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 對甲酚處理后TNF-α、IL-10及TLR-4 mRNA的表達Fig.1 Expressions of TNF-α, IL-10 and TLR-4 mRNA in THP-1 cell exposed to p-cresol

表1 不同濃度對甲酚處理后單核細胞活力的變化(%，±s，n=6)Tab.1 Changes of cell viability of THP-1 cell exposed to 20, 40, 80 and 160mg/L p-cresol (%,±s,n=6)

表1 不同濃度對甲酚處理后單核細胞活力的變化(%，±s，n=6)Tab.1 Changes of cell viability of THP-1 cell exposed to 20, 40, 80 and 160mg/L p-cresol (%,±s,n=6)

(1)P<0.05 compared with control group (0mg/L)

Concentration of p-cresol (mg/L)12 24 0 100 100 100 20 88.18±7.81 86.64±8.59 83.75±1.09 40 87.94±5.66 89.58±7.12 82.37±8.60 80 76.03±4.55(1)65.31±7.72(1) 55.17±6.24(1)160 67.25±8.48(1)57.65±6.14(1) 52.99±9.07(1)Time after exposure (h) 6

2.3 對甲酚對THP-1細胞中TNF-α、IL-10、TLR-4蛋白表達的影響 Western blotting 檢測結果顯示，對甲酚處理后，細胞TNF-α、TLR-4蛋白表達水平升高，IL-10蛋白表達水平降低，其中高劑量組與比較差異均有統計學意義(P<0.05，圖2)。

3 討 論

尿毒癥相關免疫功能障礙是過度免疫激活與免疫抑制共存的復雜狀態。炎癥反應雖然是消滅入侵病原體的必要條件，但當不能控制時就成了一柄雙刃劍[10]。心血管疾病及感染是CKD患者的主要死因，其病理過程都與免疫功能紊亂相關。尿毒癥毒素能激活機體的免疫系統，導致全身炎癥因子水平升高[11]，并能抑制單核細胞的吞噬功能，致使機體抵抗力下降[12-13]。無論是炎癥因子增高，還是機體抵抗力下降，都會對尿毒癥患者的遠期存活率和生活質量產生不利影響。

圖2 對甲酚處理后THP-1細胞TNF-α、IL-10、TLR-4蛋白的表達Fig.2 Effects of p-cresol on the protein expressions of TNF-α, IL-10 and TLR-4 in THP-1 cell

對甲酚是一種蛋白結合毒素，CKD患者血清中對甲酚水平比健康人高10倍左右，因其與血漿蛋白的結合率為94.0%，常規血液透析及腹膜透析對其清除率僅為20.0%和17.5%。在血液中蓄積的對甲酚對單核細胞抑制作用及對炎癥因子釋放的影響尚缺乏直接證據。本研究通過體外實驗發現，隨著濃度升高，對甲酚對THP-1的增殖抑制作用逐漸增強，高濃度的對甲酚可顯著抑制THP-1的增殖能力。隨著作用時間延長，對甲酚對THP-1的增殖抑制程度逐漸增強，提示尿毒癥患者體內的高濃度對甲酚可能抑制人單核細胞的增殖，導致單核細胞功能受損。

TNF-α是目前研究最為活躍的促炎細胞因子，它主要由單核-巨噬細胞激活釋放，不但能直接導致強烈的炎癥反應，還能通過誘導iNOS的表達產生大量NO，進一步加重炎癥反應[14]。雖然炎癥因子在防御病原體入侵及組織修復過程中十分必要，但其過度釋放或長期高水平存在均會引起免疫系統紊亂，導致微炎癥狀態，而在CKD患者中，TNF-α水平升高與營養不良、胰島素抵抗、血管鈣化相關[15-16]。本實驗證實，TNF-α的表達隨對甲酚處理濃度的升高而增加，提示對甲酚在患者血液中累積可能會促進單核細胞炎癥因子的釋放。這一結果與Rossi等[17]發現的對甲酚可導致尿毒癥終末期患者血漿中IL-6、TNF-α表達水平升高一致。IL-10是為數不多的抑制多種促炎因子釋放的細胞因子[18]，主要由淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞產生，可通過抑制IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的釋放，下調黏附因子并抑制氧自由基的產生等方式抑制炎癥的發生[16]。因此IL-10釋放減少可導致機體炎癥反應缺乏控制，促進炎癥的發生發展。本研究證實，TNF-α的表達隨著對甲酚濃度的升高而增加，而IL-10的表達卻相應減少。這提示對甲酚在患者血液中的累積促進了炎癥因子的表達，抑制了抑炎因子的表達，從而破壞了免疫系統中炎癥調控的平衡，導致了微炎癥狀態的發生。

TLR-4在炎癥反應中起著至關重要的作用，它能通過MyD88依賴性和非MyD88依賴性途徑活化NF-κB，介導炎癥因子TNF-α以及IL-6、IL-8等的釋放[19-20]。臨床試驗證實尿毒癥患者TLR-4受體表達較健康者明顯增加，這與本研究中高濃度對甲酚作用于THP-1細胞導致細胞中TLR-4、TNF-α表達升高的結果相呼應，提示促炎因子表達增加可能是通過TLR-4介導的通路實現的。

綜上所述，對甲酚能抑制THP-1細胞增殖，抑制抑炎因子IL-10的表達，并可能通過激活TLR-4通路，促進促炎因子TNF-α表達，導致免疫系統炎癥反應平衡紊亂。免疫功能的異常以及微炎癥狀態會增加動脈粥樣硬化及感染的風險。在未來的臨床實踐中，增加體內對甲酚的有效清除，有可能改善CKD患者的微炎癥狀態。

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An in vitro study of effects of the uremic toxin p-cresol on release of inflammatory cytokines from monocytes

DING Yu1, WANG Jian2, LIANG Xin1, WEI Xing-xue1, ZOU Zhong-ming2, YUAN Fa-huan1*1Kidney Disease Center of PLA, Chongqing Research Institute of Kidney Disease, Key Specialties of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Department of Nephrology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China
2Institute of Toxicology, School of Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

ObjectiveTo evaluate the effect of uremic toxin p-cresol on the release of inflammatory cytokines from monocytes and explore its potential mechanism.MethodsCCK-8 was employed to evaluate the proliferation status of monocytes cell-line THP-1 after being exposed to 20, 40, 80, 160mg/L of p-cresol for 6, 12 or 24h, while 40mg/L and 80mg/L were assigned as low-dose group and high-dose group. RNA and protein were extracted. RT-PCR and Western blotting were employed to evaluate the mRNA and protein expression of proinflammatory cytokine TNF-α, anti-inflammatory cytokine IL-10, as well as Toll-like receptor-4 (TLR-4) of THP-1 cell exposed to p-cresol for 24h.ResultsP-cresol depressed the proliferation ability of THP-1 in a dose- and time-dependent manner (P<0.05). RT-PCR and Western blotting showed that both TNF-α and TLR-4 were over-expressed in THP-1 cell exposed to p-cresol, while the expression of IL-10 was reduced (P<0.05). Conclusion P-cresol may inhibit both the proliferation of THP-1 cell and the release of IL-10. By up-regulating the expression of TLR-4, p-cresol may stimulate the release of TNF-α, resulting in microinflammation.

monocytes; uremia; cytokines; p-cresol

R692

A

0577-7402(2015)01-0035-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.01.08

2014-10-12；

2014-12-04)

(責任編輯：張小利)

丁瑜，碩士研究生。主要從事慢性腎病發病機制及治療方面的研究

400037 重慶 第三軍醫大學附屬新橋醫院腎內科、全軍腎臟病中心、重慶市腎臟病研究所、國家中醫藥管理局重點專科(丁瑜、梁新、韋杏雪、袁發煥)；400038 重慶第三軍醫大學預防醫學系毒理學研究所(王健、鄒仲敏)

]袁發煥，E-mail：yuanfh023@126.com

*Corresponding author, E-mail: yuanfh023@126.com