體外誘導脂肪來源干細胞向黏膜上皮細胞分化的研究

王程，徐瀟，陳沖，李梁，閆俊靈，湯蘇陽

體外誘導脂肪來源干細胞向黏膜上皮細胞分化的研究

王程，徐瀟，陳沖，李梁，閆俊靈，湯蘇陽

目的探討在體外誘導脂肪來源干細胞(ADSCs)分化為黏膜上皮細胞的可能性。方法獲取成年人皮下脂肪組織，進行ADSCs的分離、培養，擴增至第三代進行細胞免疫表型、分化情況及遺傳穩定性鑒定。分別采用含10%胎牛血清、8μg/L表皮生長因子(EGF)、10%胎牛血清+8μg/L EGF、10%胎牛血清+8μg/L EGF+30%成纖維細胞培養基、10%胎牛血清+30%成纖維細胞培養基的DMEM培養液進行培養，于培養前及培養后7、14d觀察各組細胞的光鏡特征，采用免疫組織化學染色檢測特異性細胞表面標記物的表達以及Western blotting方法檢測誘導前后ADSCs中CK-7、CK-14的蛋白表達水平。結果與未加EGF誘導劑培養組比較，經EGF誘導14d后多數ADSCs細胞形態、排列方式發生改變。CK-19免疫組化染色顯示呈強陽性。Western blotting檢測結果提示誘導后的黏膜上皮細胞特異性蛋白CK7、CK14呈高表達。結論ADSCs在一定誘導條件下可向黏膜上皮樣細胞分化。

脂肪干細胞；表皮生長因子；上皮樣細胞；細胞分化

脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞[1]，能夠在體外穩定增殖且衰亡率低，同時具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細胞、適宜大規模培養等優點，目前已證實其具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、心肌細胞、神經細胞等方向分化的能力[2]，是一種很有前景的組織工程種子細胞。本研究采用表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)作為誘導劑，觀察其對脂肪來源干細胞生長分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 24孔培養板(Falcon公司)，6cm及10cm培養皿、25cm2及75cm2培養瓶(Corning公司)，胰蛋白酶、DMEM培養液、胎牛血清(Gibco BRL公司，美國)，Ⅰ型膠原酶、PBS緩沖液、EGF(Peprotech Inc.，美國)，成纖維細胞培養基(Hyclone公司)，CD19、CD34、CD90、CD105抗人單克隆抗體，人抗細胞角蛋白7、14、19(CK-7、CK-14、CK-19)單克隆抗體(Abcam，China)，流式細胞儀(Becton Dickinson company，BDFAesAria)。

1.1.2 細胞來源 選取在武警總醫院皮膚再生醫學科行脂肪抽吸術后廢棄的人體腹部、臀部、大腿皮下脂肪組織混懸液。所有患者均簽訂知情同意書，并經武警總醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 自體脂肪干細胞的分離、培養與鑒定 入選患者(均為成年人)行血液常規檢查及傳染病抗原、抗體檢查(包括各項肝炎、梅毒、艾滋病抗體)。從患者腹部、臀部或大腿吸取脂肪，均勻分至50ml離心管中，操作中注意無菌原則。放入離心機中，500×g離心5min。離心后將上層脂肪傾倒于50ml離心管中，每個離心管至多25ml。將適量濃度胰蛋白酶和膠原酶加入離心管至50ml，使其在離心管內的終濃度均為0.1%，然后置入水浴振蕩器中，37℃、220r/min振蕩30～45min，觀察脂肪逐漸變為乳糜狀，置入離心機，2000r/min離心5min，棄上層脂肪及上清，加入適量PBS重懸細胞沉淀，吹打后接種于H-DMEM培養液(含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100mg/L鏈霉素)中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，24h后換液，棄去未貼壁的細胞，每隔3～4d換液，倒置顯微鏡(Leica)觀察細胞生長情況，接近80%融合時用0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)室溫消化5～10min，按1:3比例傳代培養。傳至第3代時，觀察細胞形態及活性，并采用流式細胞儀進行表型檢測(CD34、CD73、CD90、CD105)。

1.2.2 流式細胞儀檢測 取第3代ADSCs，經0.25%胰酶室溫消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌離心后，加入人抗廣譜角蛋白多克隆抗體(Maxim公司)，工作濃度1:20，4℃孵育30min。PBS洗滌3次，加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的人抗兔二抗(Sigma公司)，工作濃度為1:200，4℃孵育30min。PBS洗滌3次后，分別標記CD19、CD34、CD73、CD90，采用流式細胞儀進行檢測。

1.2.3 EGF誘導ADSCs分化 取第3代ADSCs接種于24孔板(2000個/孔)，分別加入含不同成分的培養液進行培養。A組：DMEM培養液，10%胎牛血清；B組：DMEM培養液，8μg/L EGF(Peperotech)；C組：DMEM培養液，10%胎牛血清，8μg/L EGF；D組：DMEM培養液，10%胎牛血清，8μg/L EGF，30%成纖維細胞培養基；E組：DMEM培養液，10%胎牛血清，30%成纖維細胞培養基。

1.2.4 吉姆薩染色 ①涂片的制作與固定：用移液槍吸取10～20μl待檢溶液滴在載玻片上，均勻涂布，室溫下陰干后，用Camon固定液固定涂片10min。②染色：置吉姆薩工作液30min。③洗脫：染色完成后，涂片立即用ddH2O洗脫。④顯微鏡觀察：用甘油壓片，指甲油封固。在100×油鏡下觀察。

1.2.5 免疫組織化學染色 取誘導前和誘導后7、14d的細胞，采用SP法進行CK-19免疫組織化學染色，嚴格按照Maxim生物技術有限公司提供的免疫組織化學染色試劑盒說明書操作，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。兔抗廣譜角蛋白多克隆抗體(Maxim)工作濃度為1:100，采用蘇木素進行復染，以非特異血清代替一抗作為陰性對照。角蛋白19(cytokeratin-19，CK-19)陽性細胞胞質呈深藍色。

1.2.6 Western blotting檢測ADSCs中CK-7、CK-19的蛋白表達水平 取誘導前及誘導后14d的細胞，提取細胞總蛋白，采用NC膜進行蛋白質電轉移(轉移條件：200mA，2h)，然后將NC膜轉移至含5%封閉液的托盤中，4℃過夜。棄封閉液，PBST洗膜3次，每次10min。加入一抗(1:100)孵育2h。PBST洗膜3次，每次10min。再加入HRP標記的二抗(用封閉液稀釋，1:200)孵育1h。PBST洗膜3次，每次10min。加入配制好的增強化學發光( ECL)底物液，X線片曝光，暗室顯影，定影，洗片。BCA法檢測蛋白含量，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉，吸棄封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃緩慢搖動孵育1h，回收一抗，加入Western洗滌液，緩慢搖動洗滌5～10min，共洗滌3次，吸棄洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃緩慢搖動孵育1h，回收二抗，加入Western洗滌液，緩慢搖動洗滌5～10min，共洗滌3次。ECL底物發光檢測誘導前后ADSCs中CK-7、CK-19的表達水平。

圖1 原代ADSCs形態觀察(×100)Fig. 1 Morphological observation of primary adipose-derived stem cells (×100)Most of the cells had attached to the wall, spindle shaped, with small amount of non-adherent circular lymphocytes (24h after inoculation, inverted microscope)

2 結 果

2.1 ADSCs的分離、培養、擴增 脂肪細胞懸液接種于培養瓶后，原代細胞經過24h體外培養后有大量貼壁細胞(圖1)，在4d內呈相對靜止狀態，之后細胞生長速度加快，并呈克隆樣生長，12d左右達到細胞融合，細胞形態呈長梭形，比較均一。

2.2 自體ADSCs免疫表型鑒定結果 流式細胞檢測顯示，第3代ADSCs表面標記物CD73、CD90陽性率均大于95%，CD19、CD34陽性率低于3%(圖2)。

2.3 誘導分化細胞的形態學和免疫組織化學鑒定吉姆薩染色結果顯示，誘導分化前各組ADSCs在體外均正常生長和增殖，呈成纖維細胞形態，為長梭形(圖3)。誘導7d后對ADSCs進行觀察，除單純EGF誘導組(B組)可見細胞死亡外，其余各組細胞形態無明顯變化，仍呈長梭形。在誘導14d后，EGF和成纖維細胞培養基聯合誘導組(D組)細胞呈多邊形單層生長，呈“鵝卵石樣”分布(圖4)；除D組外，其余各組細胞仍維持其原來的形狀，且細胞分層生長，細胞因密度太大發生接觸抑制，細胞界限不清，出現老化現象。CK-19免疫組織化學染色顯示，EGF和成纖維細胞培養基聯合誘導組(D組)細胞CK-19呈強陽性表達，多數細胞胞質呈深藍色(圖4)，其余各組呈弱表達。

2.4 Western blotting檢測結果 在誘導前的ADSCs中，鼻黏膜上皮細胞特異性蛋白CK-7、CK-14均呈現低表達，而在EGF與成纖維細胞培養基聯合培養(D組)14d后，ADSCs中CK-7、CK-14蛋白表達明顯增強(圖5)。除D組外，其余各組均呈弱表達。

圖2 第3代ADSCs的免疫表型鑒定Fig. 2 Identification of immunophenotype of passage 3 adipose-derived stem cells (ADSCs) The expression rate of CD73 and CD90 were >95%, and of CD34 and CD19 were <3% in passage 3 ADSCs

圖3 誘導前ADSCs吉姆薩染色結果(×200)Fig. 3 ADSCs before induction (Giemsa staining ×200)

圖4 CK19免疫組化染色(×200)Fig. 4 Expression of CK19 in ADSCs (Immunohistochemical staining ×200)

3 討 論

近年來研究顯示，骨髓間質干細胞具有多向分化潛能，可在體內外轉化為多種不同類型的細胞，其作為組織工程的種子細胞已得到了廣泛應用[3-5]。有研究發現，骨髓間質干細胞、造血干細胞和普通的骨髓細胞均可在體內生成肺組織和其他組織類型的上皮細胞[5-8]。脂肪組織與骨髓一樣，均來源于中胚層，故ADSCs在細胞來源、生長增殖、分化潛能等方面與骨髓間質干細胞極為相似。但脂肪組織來源更為廣泛，且ADSCs能保持穩定的倍增能力，并有體外擴增簡單易行、免疫原性低和無倫理學限制等優點[9-11]，已成為目前干細胞誘導分化研究的新熱點。ADSCs作為間質干細胞，可向內、中和外三個胚層的細胞分化，在不同誘導條件下的分化方向不同。已有研究證實ADSCs可向軟骨細胞、骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞、平滑肌細胞、神經細胞、心肌細胞、肝細胞和內皮細胞等分化[12-16]。ADSCs向上皮細胞定向分化的研究報道不多，如能成功誘導分化，可以為創面修復和組織再生等臨床問題提供一種全新的解決方法。本研究通過流式細胞技術檢測培養第3代的ADSCs，發現其高表達CD73、CD90，幾乎不表達CD19、CD34，與既往研究結果一致[17-18]。

圖5 ADSCs中CK-7、CK-14蛋白表達的Western blotting檢測結果Fig. 5 Expression of CK-7 and CK-14 protein in ADSCs (Western blotting)

Baer等[19]認為細胞角蛋白(cytokeratin，CK)是在誘導分化過程中合成的第一種上皮細胞特異性結構蛋白，隨著分化過程的進展，其他的上皮細胞角蛋白(如上皮細胞角蛋白7、14、19和20)[20-21]和另外一些上皮細胞標志物如卵透明帶蛋白1 (zonaocdudensprotein 1，ZO1)[22]也逐漸獲得陽性表達，這可作為證實誘導分化成功的檢測指標之一[22]。本實驗結果也證實，在EGF與成纖維細胞培養基聯合誘導下，ADSCs可向黏膜上皮細胞分化。

EGF是最早發現的生長因子之一，它的體外作用主要是促細胞生長[23]。研究顯示，EGF可促進表皮及角膜上皮的修復[24]。成纖維細胞培養基含有多種促進表皮細胞生長的因子。本研究結果顯示，單純應用EGF不能使ADSCs向上皮分化，甚至出現細胞死亡，可能是由于在無血清狀態下，EGF不能提供足夠的營養使細胞存活，因此，ADSCs不能發生轉化。但EGF與成纖維細胞培養基聯合應用能使其表達角蛋白，在誘導第7天，免疫組織化學染色顯示極少的細胞表達角蛋白，至第14天時表達角蛋白的細胞增多，而未誘導和單純條件培養基誘導的細胞角蛋白表達陰性，可能是由于在成纖維細胞條件培養基中還含有除EGF之外的多種誘導ADSCs分化為上皮細胞的因子，如可以促進上皮細胞增殖的胰島素樣生長因子(IGF)等。

鼻黏膜上皮主要由4類細胞組成：柱狀纖毛上皮細胞、無纖毛柱狀上皮、基細胞、分泌細胞[25-26]。基細胞位于上皮層的最深面，依靠半橋粒(hemidesmosomes)錨附于基底膜[27]，不直接暴露于細胞層的腔面，其表面可特異性表達CK-14[26-28]。既往文獻報道CK-7、CK-19是鼻黏膜上皮細胞最基本的細胞角蛋白組合之一[28]。鼻黏膜上皮細胞具有屏障功能及離子、水轉運功能等重要生理功能，上皮細胞對表層液體層離子及水正常轉運是發揮黏液纖毛傳輸功能的重要基礎，已有臨床研究證實，對黏膜受損的空鼻綜合征患者，給予自體ADSCs可起到促進黏膜愈合的作用[29]，為本研究結果提供了佐證。

綜上所述，本研究結果證實，EGF與成纖維細胞培養基聯合應用可作為誘導劑，誘導ADSCs向黏膜上皮細胞分化，為后續應用ADSCs作為黏膜上皮組織工程的種子細胞用于上皮缺損的修復提供了實驗依據。但黏膜上皮細胞生長的微環境非常復雜，本研究未能完全模擬該環境，且體外誘導的上皮細胞要真正應用于臨床還有很多問題需要解決。體內誘導雖可得到組織微環境的支持，通過細胞間的接觸加速ADSCs向上皮細胞的分化，但由于干細胞向靶器官歸巢的效率較低，且散在分布于上皮細胞之間的干細胞沒有較好的方法來采集，因此很難研究干細胞的轉歸。盡管ADSCs定向分化為上皮細胞的研究還處于早期探索階段，但隨著對干細胞的分化機制、誘導方法及分化后細胞功能評價等問題的深入探討，今后將會形成比較完善和成熟的干細胞誘導分化體系，以及逐漸完善的方法學鑒定手段，并可利用組織工程技術，探索更有效的誘導手段，最終將研究成果轉化為臨床所用。

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In vitrostudy on differentiation of adipose-derived stem cells into mucosal epithelial cells

WANG Cheng, XU Xiao, CHEN Chong, LI Liang, YAN Jun-ling, TANG Su-yang*
Department of Skin and Hair Regenerative Medicine, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: 2278645614@qq.com

, E-mail: 2278645614@qq.com

ObjectiveTo explore the possibility of inducing the differentiation of adipose-derived stem cells (ADSCs) into mucosal epithelial cellsin vitro.MethodsAdult subcutaneous adipose tissue was obtained for carrying out the isolation, culture, amplification and differentiation of ADSCs, and to identify the genetic stability of the third passage. The cultures were performed with DMEM culture media containing respectively 10% fetal bovine serum (FBS), 8μg/L epidermal growth factor (EGF), 10% FBS+8μg/L EGF, 10% FBS+8μg/L EGF+30% fibroblast cell culture medium, and 10% FBS+30% fibroblast culture medium. The light microscopic characteristics of the cells were observed before culture and 7 and 14 days after culture. The expression of specific cell surface markers and expression levels of CK-7 and CK-14 proteins in ADSCs before and after induction were detected by immunohistochemical staining and Western blotting respectively.ResultsCompared with the group without EGF, the morphology and arrangement of ADSCs induced by EGF for 14d were changed. Immunochemical staining showed CK-19 was strongly positive expressed. Western blotting analysis showed that CK-7 and CK-14 were strongly expressed in the epithelial cells.ConclusionAdipose-derived stem cells can be differentiated into mucosal epithelioid cellsin vitro.

adipose-derived stem cells; epidermal growth factor; epithelioid cells; cell differentiation

Q254

A

0577-7402(2015)10-0798-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.10.06

2015-05-16；

2015-08-22)

(責任編輯：胡全兵)

王程，醫學碩士。主要從事再生醫學和整形外科方面的基礎與臨床研究

100039 北京 武警總醫院皮膚再生醫學科(王程、徐瀟、陳沖、李梁、閆俊靈、湯蘇陽)

湯蘇陽，E-mail：2278645614@qq.com