螺內酯對截肢創傷后大鼠腎損傷的防護作用及其機制

張穎，張海峰，任青愛，謝曉華

螺內酯對截肢創傷后大鼠腎損傷的防護作用及其機制

張穎，張海峰，任青愛，謝曉華

目的探討螺內酯對截肢后大鼠腎臟的保護作用及其可能機制。方法健康成年雄性Wistar大鼠42只，隨機分為正常對照組，手術后6、24、48、72h組及螺內酯干預組，每組7只。測定血漿尿素氮(Ur)、肌酐(Cr)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、白介素6(IL-6)、一氧化氮(NO)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)濃度及腎組織MPO、MDA、ALD含量和鈣調神經磷酸酶(CaN)mRNA表達水平，光鏡觀察腎組織的形態學變化。結果截肢后6h大鼠腎組織出現損傷性變化；血漿Cr、AngⅡ、MDA、MPO、IL-6濃度及腎組織MDA、MPO含量升高，血漿及腎組織ALD水平在截肢后6h降低，隨后升高；腎組織中CaN mRNA表達水平在截肢后明顯升高。螺內酯干預后腎組織損傷有所減輕，血漿MPO、IL-6、AngⅡ濃度及腎組織MPO、ALD含量和CaN mRNA表達水平顯著降低，血漿NO濃度顯著升高，但血漿Cr、Ur、MDA、ALD濃度及腎組織MDA含量無明顯變化。結論螺內酯對截肢后大鼠腎損傷具有保護作用，其機制可能與抑制醛固酮分泌、降低CaN mRNA的表達及活化，從而減少炎癥因子的釋放有關。

截肢術；急性腎損傷；鈣神經素；螺內酯

螺內酯(spirolactone)又名安體舒通(antisterone)，為非特異性的醛固酮拮抗劑，作為保鉀利尿劑已廣泛應用于臨床。螺內酯可阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensinaldosteronesystem，RAAS)的部分作用，在高血壓的治療中具有很好的作用，近年來又發現其對減輕組織器官纖維化、改善腎功能具有積極作用[1]。有研究顯示，慢性腎臟疾病患者加用螺內酯治療后，血壓未發生明顯變化，而尿蛋白排泄率明顯下降(約54%)[2]，對糖尿病腎病患者的研究也得到了類似結果[3-4]。但螺內酯對于創傷導致的急性腎損傷有無保護作用鮮見文獻報道。本研究通過建立截肢大鼠模型，探討螺內酯對創傷后急性腎損傷的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雄性Wistar大鼠42只，體重260～300g，購自解放軍總醫院實驗動物中心，室溫條件下標準飼料喂養。本實驗符合動物倫理學要求。將大鼠隨機分為正常對照組，手術后6、24、48、72h組及螺內酯干預組，每組7只。正常對照組：麻醉后迅速處死；手術后6、24、48、72h組分別在肢截肢術后6h、24h、48h、72h處死；螺內酯干預組大鼠在截肢前行螺內酯20mg/kg灌胃，1次/d，持續1周，術后6h處死。截肢模型的建立：大鼠以3%異戊巴比妥鈉(80mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，于左側腹股溝處切開皮膚，游離股動靜脈，結扎腹壁淺動靜脈及其他分支血管，膝關節上方1.2～1.4cm處完全切斷除股靜、動脈以外的所有結構，縫扎止血，最后剪斷股靜、動脈，建立大鼠左后肢截肢模型。各組大鼠于相應時間點斷頭處死后開腹分離腎臟，取左腎組織約500mg，置冰冷生理鹽水中清洗殘存血液后待用。處死動物后，立即留取下腔靜脈血，4℃下3000r/min離心6min，分離血漿待用。

1.2 主要儀器與實驗材料 SYNERGY HT多功能酶標儀購自Bio-Tek公司，PCR儀購自Eppendorf公司，JY200電泳儀購自北京六一儀器廠，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，PCR試劑盒購自天根生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 腎組織病理組織學檢查 取大鼠左腎組織，以4%甲醛溶液固定后石蠟包理，連續5μm切片、烤片后二甲苯脫脂，梯度乙醇脫水，HE染色，常規脫水、透明、中性樹脂封固，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 血漿及腎臟MPO、MDA含量的測定 MPO含量測定采用比色法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法，所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所，具體操作按說明書進行。

1.3.3 血漿尿素氮(Ur)、肌酐(Cr)、白介素6(IL-6)、一氧化氮(NO)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)濃度及腎臟ALD含量的測定 血漿Ur、Cr濃度采用日立7600全自動生化分析儀進行測定，IL-6、NO、AngⅡ、ALD濃度采用放免法測定(委托解放軍總醫院東亞放免所完成)。

1.3.4 腎臟鈣調神經磷酸酶(calcineurin，CaN)mRNA表達水平的檢測 采用RT-PCR法測定腎臟CnAα mRNA的含量。首先提取腎組織mRNA，然后進行RNA鑒定，反轉錄合成cDNA，使用軟件Primer 5.0設計CnAα(CnAα為CaN催化亞單位的一種主要同工酶，僅分布于腎小管)特異性引物，序列如下：CnAα正義5'-GAAGGCAGGCTGGAAGAAAGTGTC-3'，反義5'-GAAGGCAGTCGAAGGCATCCATA-3'，擴增產物大小400bp；內參照β-actin正義5'-CTATCGGCAATGAGC GGTTC-3'，反義5'-CTTAGGAGTTGGGGGTGGCT-3'，擴增產物大小762bp。

1.4 統計學處理 采用SPSS 12.0軟件進行統計分析，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

圖1 截肢后大鼠腎臟的病理變化(HE×200)Fig. 1 Pathological changes of kidney tissue in rats after amputation (HE×200)A. Normal control group; B. 6h after amputation group; C. Spirolactone intervention group

2 結 果

2.1 截肢后大鼠腎臟結構的變化 光鏡觀察顯示，截肢后大鼠出現不同程度的腎組織損傷，主要包括腎小球、腎間質充血，腎小球、腎小管上皮細胞腫脹，腎間質伴有少量炎性細胞浸潤，螺內酯干預后腎組織損傷略有減輕(圖1)。

2.2 截肢后大鼠血漿各檢測指標的變化及螺內酯的影響 與正常對照組比較，大鼠血漿Cr在截肢后24h明顯升高，72h達峰值，而Ur在截肢后各時間點無明顯變化；AngⅡ在截肢后6h明顯升高(P<0.05)，此后開始下降，72h降至基本正常；ALD在截肢后6h明顯降低(P<0.05)，截肢后24h開始顯著升高(P<0.05)，到72h呈持續性升高(P<0.05)；MPO在截肢后6h明顯升高(P<0.01)，此后逐漸降低，至72h恢復至正常對照組水平；MDA在截肢后6h明顯升高(P<0.01)，此后逐漸降低，至72h仍高于正常對照組(P<0.05)；IL-6在截肢后6h明顯升高(P<0.01)，此后逐漸下降，至72h降至正常對照組水平；NO在截肢后6h明顯降低(P<0.05)，截肢后24h恢復至正常對照組水平(P>0.05)。與截肢后6h后比較，螺內酯干預后血漿Cr、Ur、ALD、MDA無明顯變化，而AngⅡ、MPO、IL-6明顯降低(P<0.05，P<0.01)，NO明顯升高(P<0.01，表1)。

表1 截肢后大鼠血漿各檢測指標的變化(±s，n=7)Tab. 1 Changes of plasma indexes in rats after amputation (±s,n=7)

表1 截肢后大鼠血漿各檢測指標的變化(±s，n=7)Tab. 1 Changes of plasma indexes in rats after amputation (±s,n=7)

(1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with normal control; (3)P<0.05, (4)P<0.01 compared with 6h after amputation group

Group Cr (μmol/L) Ur (mmol/L) AngⅡ(pmol/L) ALD (pg/ml) MPO (U/L) MDA (μmmol/L) IL-6 (pg/ml) NO (μmol/L) Normal control 17.1±1.7 9.4±1.2 457±32 189±19 60±7 5.2±0.4 40±6 12.9±1.5 6h after amputation 19.0±2.4 9.3±1.4 685±78(1) 153±29(1) 84±7(2) 10.2±2.7(2) 59±14(2) 8.6±0.9(1)24h after amputation 21.3±2.7(2) 9.7±2.0 566±42(1) 346±63(1) 79±6(2) 8.8±1.4(2) 61±9(2) 11.1±1.2 48h after amputation 23.1±2.1(2) 9.7±1.6 538±52(1) 409±54(1) 72±4(1) 8.4±1.1(2) 49±7(1) 11.3±1.2 72h after amputation 24.3±2.1(2) 10.0±1.5 498±45 490±50(1) 66±7 6.9±2.2(1) 35±7 11.1±1.4 Spirolactone intervention 20.3±1.5 9.7±2.3 512±56(3) 166±44 76±5(3) 9.3±1.5 39±7(4) 19.6±1.3(4)

2.3 截肢后大鼠腎組織MPO、MDA、ALD含量和CaN mRNA表達水平的變化及螺內酯的影響 與正常對照組比較，腎組織MPO在截肢后6h明顯升高(P<0.01)，此后逐漸降低，至72h恢復至正常對照組水平；MDA在截肢后6h明顯升高(P<0.01)，此后逐漸降低，至72h已降至正常對照組水平(P>0.05)；ALD在截肢后6h明顯降低(P<0.05)，截肢后24h開始顯著升高(P<0.05)，到72h呈持續性升高(P<0.05)；腎組織CnAα mRNA表達水平在截肢后6h明顯升高(P<0.01)，此后逐漸下降，至72h降至正常對照組水平(P>0.05)。與截肢后6h后比較，螺內酯干預后腎組織MDA含量無明顯變化，MPO含量及CaN mRNA表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)，ALD含量明顯升高(P<0.01，表2)。

表2 截肢后大鼠腎組織MPO、MDA、ALD含量和CaN mRNA表達水平的變化(±s，n=7)Tab. 2 Changes of MPO,MDA, ALD contents and CaN mRNA levels in rats after amputation (±s,n=7)

表2 截肢后大鼠腎組織MPO、MDA、ALD含量和CaN mRNA表達水平的變化(±s，n=7)Tab. 2 Changes of MPO,MDA, ALD contents and CaN mRNA levels in rats after amputation (±s,n=7)

(1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with normal control; (3)P<0.05, (4)P<0.01 compared with 6h after amputation group

Group MPO (U/g) MDA (nmol/mg prot) ALD (pg/mg prot) CaN mRNA Normal control 0.16±0.03 2.00±0.23 20.86±2.80 1.36±0.35 6h after amputation 0.32±0.02(2) 3.73±0.36(2) 15.43±2.23(2) 3.11±0.35(2)24h after amputation 0.26±0.02(2) 3.13±0.28(2) 33.43±2.99(2) 2.28±1.13(2)48h after amputation 0.23±0.02(2) 2.55±0.25(2) 35.43±3.60(2) 1.78±0.36(1)72h after amputation 0.19±0.02 2.15±0.24 38.86±3.44(2) 1.51±0.26 Spirolactone intervention 0.29±0.02(3) 3.37±0.36 27.43±3.60(4) 1.12±0.17(4)

3 討 論

研究證實，在創傷、燒傷、手術等應激條件下體內可發生炎癥反應，釋放大量炎性介質，如IL-1、IL-6、NO、腫瘤壞死因子(TNF-α)、急性期反應蛋白(ARP)等，導致各類炎癥細胞聚集、增多，最終可使促炎介質和抗炎介質失去平衡，引起一系列連鎖反應或瀑布效應即全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，從而導致多個臟器功能受損甚至多器官衰竭[5-6]。高容量血液濾過(HVHF)可清除炎癥介質，改善單核細胞及內皮細胞功能[7-8]，阻斷心臟手術后急性腎損傷(AKI)合并多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)患者由SIRS向MOF方向發展，降低患者死亡率，尤其是早期應用該治療者效果明顯[9-10]。本研究發現截肢后大鼠血漿及腎組織IL-6、MDA、MPO明顯升高，推測炎癥反應在截肢創傷導致腎損傷的病理生理過程中起著重要作用，此外還發現血漿ALD濃度雖然在截肢后出現短暫降低，但很快升高，因此考慮RASS系統激活同樣是導致急性腎損傷的機制之一。已有研究證實ALD可通過導致腎小球纖維化、體內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)增多、促發炎癥因子釋放等引起腎臟損傷，而醛固酮受體拮抗劑螺內酯具有抗炎、降低氧化應激水平的作用[11-14]。本研究結果顯示螺內酯干預組IL-6、MPO水平顯著降低，但Cr、MDA并無明顯改變，可能與使用劑量較小、時間較短及腎臟損傷較輕有關。

本研究發現截肢后大鼠腎臟CnAα mRNA表達明顯增強，提示該信號通路可能也參與了截肢導致的腎臟損傷機制。CaN屬絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(又稱蛋白磷酸酶2B，PP2B)家族，是迄今發現的唯一受Ca2+/鈣調素(CaM)調節的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶。人體內的CaN由一個催化亞單位(CnA)和一個調節亞單位(CnB)組成，CnA有三種主要的同工酶：CnAα、CnAβ、CnAγ。CnAα和CnAβ呈特征性分布，前者僅分布于腎小管，而后者分布于腎小球。目前認為CaN是一種廣泛分布的、參與多種細胞功能調節的多功能信號酶，在T細胞活化中起著調節樞紐的作用[15]，可調節IL-2、IL-4及CD40L等基因的表達。此外有研究發現CaN的活化可調節β趨化因子(regulated upon on activation on normal T cell expressed and secreted，RANTES)的表達，而RANTES可激活T淋巴細胞，導致炎癥因子的釋放，進而加重腎臟損傷[16]，還有學者發現IL-4及CD40-CD40L共刺激信號可通過活化腎小管上皮細胞CaN，調控RANTES的基因表達、分泌及合成，因此考慮CaN的活化可能參與了腎小管上皮細胞的炎癥過程[17]。本研究發現螺內酯干預可下調CnAα基因的表達，提示螺內酯抑制CaN的活化可能是其減輕腎臟損傷的機制之一。

綜上所述，本研究結果表明，截肢創傷可引起全身應激反應，激活RAAS系統、活化CaN、釋放大量炎癥因子而導致腎臟損傷，螺內酯可明顯抑制RAAS系統、CaN的活化并減少炎癥因子的釋放，RAAS系統與CaN可能存在某種關聯機制。既往有研究發現內源性醛固酮可通過激活CaN信號傳導通路而參與腎性高血壓大鼠靶器官的損傷[18]，螺內酯可通過抑制CaN的活性，減輕腎性高血壓大鼠的心肌肥大[19]。因此推測螺內酯可能通過抑制ALD，下調CaN基因的表達與活化，減少炎癥因子釋放，進而對腎臟起保護作用，但其具體機制仍有待進一步深入研究。

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Protective effect of spirolactone on kidney damage in rats after amputation and its mechanism

ZHANG Ying, ZHANG Hai-feng, REN Qing-ai, XIE Xiao-hua*
Surgery Department of South Building, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: n4xxh@126.com

, E-mail: n4xxh@126.com
This work was supported by the “Twelfth Five-Year Plan” Key Scientific Research Foundation of PLA (BWS12J051)

ObjectiveTo explore the protective effect and its possible mechanism of spirolactone against kidney injury in rats after amputation.MethodsForty-two male Wistar rats were randomly divided into 6 groups:normal control, 6 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours after the operation and spirolactone intervention groups (n=7, each). Plasma angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ), aldosterone (ALD), myeloperoxidase (MPO), malondialdehyde (MDA), interleukin-6 (IL-6), nitric oxide (NO), urea nitrogen (Ur), creatinine (Cr) concentration and renal tissue ALD, MPO, MDA and calcineurin (CaN) mRNA levels were determined. Renal pathological changes were observed by light microscopy.ResultsAt 6h after amputation, traumatic changes in rat kidney tissue were seen, and the levels of Cr, AngⅡ, MDA, MPO, IL-6 and CaN-mRNA were significantly elevated, while NO concentration was significantly lowered. Spirolactone intervention reduced the damage of kidney tissue, and the levels of MPO, IL-6, Ang Ⅱ in plasman, contents of MPO and ALD and expression level of CaN mRNA in kidney tissue were significantly lowered, but the levels of Cr, Ur, MDA and ALD in plasma and content of MDA in kidney tissue showed no significant change.ConclusionSpirolactone can provide protective effect against renal damage in rats after amputation, and it may be related to the mechanism that spirolactone inhibits secretion of ALD and lowers the expression and activation of CaN mRNA, thus reducing the release of pro-inflammatory factors.

amputation; acute kidney injury; calcineurin; spirolactone

R687.5

A

0577-7402(2015)07-0564-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.10

2015-01-17；

2015-06-22)

(責任編輯：胡全兵)

軍隊“十二五”重點科研課題(BWS12J051)

張穎，主治醫師，碩士研究生。主要從事圍術期器官損傷與防護方面的研究

100853 北京 解放軍總醫院南樓綜合外科(張穎、張海峰、任青愛、謝曉華)

謝曉華，E-mail：n4xxh@126.com