拉帕替尼誘導人鼻咽癌CNE-2Z細胞周期阻滯和細胞凋亡觀察

屠彥紅，李娜，高士秀，肖鶴，宋若會

拉帕替尼誘導人鼻咽癌CNE-2Z細胞周期阻滯和細胞凋亡觀察

屠彥紅，李娜，高士秀，肖鶴，宋若會

目的探討拉帕替尼對人鼻咽癌CNE-2Z細胞周期和凋亡的影響及其作用機制。方法采用CCK-8法檢測拉帕替尼對CNE-2Z細胞增殖的影響，PI染色后以流式細胞術進行細胞周期分析，Annexin V/PI雙標記法檢測細胞凋亡，實時定量PCR檢測細胞周期相關分子Cyclin D1、P21和P53的mRNA表達水平，Western blotting檢測Cyclin D1、P21、P53及凋亡相關蛋白Mcl-1和Bax的表達，利用Apo-ONE Homogeneous caspase-3/7檢測試劑盒檢測Caspase-3/7酶活性。結果拉帕替尼呈劑量依賴性地抑制CNE-2Z細胞增殖，并可誘導CNE-2Z細胞發生明顯的細胞周期G0/G1期阻滯，促進細胞凋亡，下調Cyclin D1并上調P21、P53 mRNA和蛋白表達，下調Mcl-1和上調Bax蛋白表達，并誘導CNE-2Z細胞內caspase-3/7激活。結論拉帕替尼可有效抑制人鼻咽癌CNE-2Z細胞增殖，誘導細胞周期阻滯并促進其凋亡，可作為治療鼻咽癌的潛在藥物。

拉帕替尼；鼻咽腫瘤；細胞周期；細胞凋亡

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中國常見的惡性腫瘤之一。盡管鼻咽癌的治療和早期診斷已取得顯著進展，但Ⅲ期和Ⅳ期患者的預后依然很差，局部區域復發和遠處轉移仍是鼻咽癌治療失敗的兩大主因[1]。因此，尋找新的對鼻咽癌安全有效的治療藥物是目前亟待解決的問題。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)同屬于表皮生長因子酪氨酸激酶受體家族。其中，EGFR與多種腫瘤的發生和發展密切相關，如結腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和膀胱癌等均伴隨EGFR的過表達。此外，在大約30%的乳腺癌和卵巢癌患者體內檢測到HER2基因增高或過表達。近年研究證實，超過30%的鼻咽癌患者體內HER2過表達，且與預后差、轉移快相關[2-3]。拉帕替尼(lapatinib)是一類口服的雙靶點小分子酪氨酸激酶抑制劑，同時作用于EGFR和HER2兩個靶點[4]，目前在臨床上與卡培他濱(capecitabine)合并用于治療經一線藥物治療失敗的晚期或轉移性乳腺癌[5]，但在鼻咽癌中的研究尚處于起步，國內未見相關報道。本研究采用人鼻咽癌細胞系CNE-2Z，研究拉帕替尼對該細胞系增殖、細胞周期和凋亡的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 細胞系CNE-2Z購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。拉帕替尼購自美國Selleck公司；化合物儲存液用DMSO配制，使用時用培養液稀釋，使DMSO終濃度不超過0.05%；RPMI 1640培養液、胎牛血清均購自美國Gibco公司；碘化丙啶(PI)、RNAase購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；Annexin V-FITC檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司；Z-VAD-FMK、Apo-ONE Homogeneous caspase-3/7試劑盒購自美國Promega公司；抗Cyclin D1、P21、P53、Mcl-1和Bax等單克隆抗體均購自Cell Signaling公司；GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶顯色底物ECL購自Cell Signaling公司。FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；DNM-9602G型酶標儀購自北京普朗新技術有限公司；CO2培養箱購自日本三洋公司；微孔板熒光檢測儀(Wallac Victor)購自美國Perkin Elmer公司；定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養 將CNE-2Z細胞接種于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養液中，在5%CO2、飽和濕度、37℃培養箱中培養，每2～3d傳代1次。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數生長期的CNE-2Z細胞接種于96孔培養板中，每孔2×104個細胞。培養24h后，吸棄培養液，加新鮮含10%血清培養液180μl，對照組加入含0.05% DMSO的培養液20μl，藥物處理組加入不同濃度的拉帕替尼溶液各20μl，使終濃度分別為1.56、3.13、6.25、12.5、25、50及100μmol/L，其中DMSO含量不超過0.05%。同時設立調零組(無細胞組)，加入200μl培養液。培養48h后加入10μl CCK-8孵育2h，酶標儀于波長490nm處讀取吸光度(A)值。根據公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=[(A藥物處理組－A調零組)/ (A對照組－A調零組)]×100%。繪制劑量效應曲線，計算拉帕替尼對CNE-2Z細胞的半數抑制濃度(IC50)。

1.4 PI單染法檢測細胞周期 取對數生長期細胞，以2×105/ml密度接種于6孔板中，使拉帕替尼終濃度為6.25、12.5、25μmol/L，空白對照組給予等體積的DMSO。培養24h后，離心收集細胞(500g×5min)，70%冰乙醇4℃固定過夜，細胞離心棄上清，PBS溶液洗滌2次，加入100μl(1mg/ml) RNase A酶，37℃處理30min，PI(100μg/ml)染色，流式細胞儀上機檢測。

1.5 Annexin V/PI雙標方法檢測細胞凋亡 細胞處理同1.4。培養48h后，離心收集單細胞懸液(500g×5min)，PBS洗滌1次，每個樣品中加入100μl Annexin V-FITC，室溫孵育15min，加入400μl PI(50μg/ml)，流式細胞儀檢測。

1.6 Caspase-3/7活性檢測 Caspase-3/7活性檢測按Apo-ONE Homogeneous caspase-3/7試劑盒說明書進行。細胞經藥物處理后，加入100μl含Z-DEVD-羅丹明110的caspase-3/7緩沖液，培養板置室溫避光反應2h，用微孔板熒光檢測儀測定在激發光波長485nm、發射光波長535nm處的熒光值。

1.7 實時定量PCR檢測細胞周期相關分子mRNA表達 取對數生長期的CNE-2Z細胞，以2×105/ml密度接種于60mm細胞培養皿中，使拉帕替尼終濃度為6.25、12.5μmol/L，空白對照組加入相同含量的DMSO。24h后離心收集細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA，用分光光度法測濃度，按照Thermo反轉錄試劑盒說明書進行操作，各目的基因及內參基因GAPDH的引物見表1。反應程序為：95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 60s，收集熒光，39個循環。以GAPDH為內參照。采用比較循環閾值法(2–ΔΔCt)分析各組中mRNA的相對表達量。

表1 實時定量PCR引物Tab.1 Primers used in real-time quantitative PCR

1.8 Western blotting檢測細胞周期和細胞凋亡相關分子蛋白表達 取對數生長期的CNE-2Z細胞，以2×105/ml密度接種于60mm細胞培養皿中，使拉帕替尼終濃度為6.25、12.5μmol/L，空白對照組加入相同含量DMSO。24h后離心收集細胞，加入裂解緩沖液冰浴15min，4℃ 12 000×g離心10min后取上清測蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100℃下變性7min。每份樣品取20μg蛋白樣品進行SDS-PAGE，將電泳分離的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h后加入一抗4℃過夜。TBST洗脫3次，每次10min。加入相應的二抗，室溫孵育1h，TBST洗脫3次，每次10min。化學發光劑ECL孵育顯影。

1.9 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 拉帕替尼對CNE-2Z細胞增殖的抑制作用 倒置顯微鏡下觀察，CNE-2Z細胞呈單層生長，細胞形態為多角形或短梭形。經拉帕替尼處理后，細胞密度明顯降低，細胞質透亮度下降，部分細胞胞突回縮變圓，脫落呈懸浮狀，可見細胞碎片。上述變化隨著拉帕替尼作用濃度的增加而加重(圖1)。CCK-8檢測結果顯示，不同濃度的拉帕替尼處理CNE-2Z細胞48h后，對細胞增殖均有抑制作用，拉帕替尼濃度越高，其增殖抑制效應越強，呈明顯的劑量依賴性(圖2)。48h的IC50為13.96±1.05μmol/L。

圖1 拉帕替尼對CNE-2Z細胞形態的影響(比例尺=400μm)Fig.1 Effect of lapatinib on the morphology of CNE-2Z cells (bar=400μm)

圖2 拉帕替尼對CNE-2Z細胞增殖的影響Fig.2 Effect of lapatinib on the proliferation of CNE-2Z cells

2.2 拉帕替尼對CNE-2Z細胞周期的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，不同濃度(6.25～25μmol/L)的拉帕替尼作用于CNE-2Z細胞24h后，G0/G1期細胞比例均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)，S期細胞比例明顯減少(P＜0.05)，但對G2/M期細胞比例沒有明顯影響，提示拉帕替尼誘導CNE-2Z細胞發生顯著的G0/ G1期周期阻滯(表2、圖3)。

2.3 拉帕替尼誘導CNE-2Z細胞凋亡 采用Annexin V/PI雙標法分析拉帕替尼對CNE-2Z細胞凋亡的影響，結果顯示，12.5和25μmol/L拉帕替尼處理細胞48h，細胞凋亡率隨著拉帕替尼的濃度增高而增加，與對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明較高濃度拉帕替尼可顯著誘導CNE-2Z細胞發生凋亡(圖4)。

表2 拉帕替尼對CNE-2Z 細胞周期的影響(%，±s，n=3)Tab.2 Effect of lapatinib on the cell cycle distribution of CNE-2Z cells (%,±s,n=3)

表2 拉帕替尼對CNE-2Z 細胞周期的影響(%，±s，n=3)Tab.2 Effect of lapatinib on the cell cycle distribution of CNE-2Z cells (%,±s,n=3)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control group

Group G0/G1 S G2/M Control 45.05±6.88 41.81±7.39 13.14±3.17 Lapatinib(μmol/L) 6.25 73.99±4.72(2) 17.60±4.99(2) 8.41±1.07 12.5 68.63±8.26(1) 16.83±3.52(2) 14.54±4.74 25.0 68.87±7.55(1) 16.66±5.19(2) 14.46±2.77

2.4 拉帕替尼對CNE-2Z細胞周期和細胞凋亡相關分子的影響 拉帕替尼處理CNE-2Z細胞后，采用RT-qPCR檢測細胞周期調控因子的mRNA表達水平，結果顯示Cyclin D1 mRNA表達水平較對照組明顯下降(P＜0.01)，而P21和P53 mRNA表達水平較對照組顯著增加(P＜0.01，圖5)。Western blotting檢測結果顯示，不同濃度拉帕替尼處理后CNE-2Z細胞中Cyclin D1蛋白表達水平明顯降低，而P21和P53蛋白表達水平明顯升高，同時可見促凋亡分子Bax蛋白表達水平明顯升高，而抗凋亡分子Mcl-1蛋白表達水平明顯降低(圖6)。

圖3 拉帕替尼對CNE-2Z細胞周期的影響Fig.3 Effect of lapatinib on the cell cycle distribution of CNE-2Z cells

圖4 拉帕替尼對CNE-2Z細胞凋亡的影響Fig.4 Lapatinib induced apoptosis in CNE-2Z cellsA. Measurement of apoptosis in CNE-2Z cells; B. Statistic analysis of apoptosis rate; (1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control group (0μmol/L lapatinib)

圖5 拉帕替尼對細胞周期調控因子mRNA表達的影響Fig.5 Lapatinib regulated mRNA expression of cell cycle related moleculars A. Cyclin D1; B. P21; C. P53; (1)P＜0.01 compared with control group (0μmol/L lapatinib)

2.5 拉帕替尼對CNE-2Z細胞caspase-3/7酶活性的影響 采用Apo-ONE Homogeneous caspase-3/7試劑盒檢測caspase-3/7激酶活性變化，結果顯示，CNE-2Z細胞經拉帕替尼處理24h后，隨著藥物濃度的增高，caspase-3/7酶活性逐漸增強，其中12.5～25μmol/L拉帕替尼作用后caspase-3/7酶活性與對照組比較明顯升高(P＜0.01，圖7)。

圖6 拉帕替尼對細胞周期和細胞凋亡相關分子蛋白表達的影響Fig.6 Lapatinib regulated protein expression of cell cycle and apoptosis related moleculars

圖7 拉帕替尼對Caspase3/7酶活性的影響Fig.7 Measurement of caspase 3/7 activation by kinase activity assay(1)P＜0.01 compared with blank control group (0μmol/L)

3 討 論

EGFR和HER2及其相關下游信號通路的異常表達與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關，許多新型靶向治療藥物均是通過抑制這兩種受體的活性而發揮抗癌作用的。拉帕替尼通過同時靶向抑制EGFR 和HER2及其介導的腫瘤細胞增殖和生長的信號通路而發揮抗腫瘤活性，目前在臨床上用于聯合卡培他濱治療HER2過度表達且既往接受過包括蒽環類、紫杉醇、曲妥珠單抗(赫賽汀)治療的晚期或轉移性乳腺癌[5]。此外，拉帕替尼還對胰腺癌、食管癌等其他腫瘤具有明顯的抑制作用[6-7]。國外研究也證明拉帕替尼具有抑制鼻咽癌細胞增殖的作用[8]。

本研究發現拉帕替尼可顯著抑制CNE-2Z細胞增殖，并誘導細胞周期G0/G1期阻滯。Cyclin D1是周期蛋白家族中重要的調控因子。在細胞周期進程中，Cyclin D1與CDK4/6結合并激活CDK4/6為細胞從G0期進入G1期所必需[9]。P21是一種細胞周期抑制蛋白，可通過抑制CDK4/6-Cyclin D復合物導致細胞周期G1期阻滯。此外，P21是抑癌基因P53的下游信號分子，P53可以轉錄激活P21基因，調控P21的表達[10]。本研究結果顯示，拉帕替尼可能通過降低Cyclin D1表達，并引起P21和P53的表達上調，從而使CNE-2Z細胞發生G0/G1期阻滯。

本研究發現，較高濃度拉帕替尼能誘導CNE-2Z細胞發生凋亡。Bcl-2家族成員與細胞凋亡密切相關，其抗凋亡成員和促凋亡成員之間可競爭性形成同源或異源二聚體(如Bcl-2/Bax、Mcl-1/Bax等)而決定細胞是否發生凋亡[11]。Mcl-1和Bax分別是Bcl-2家族中重要的凋亡抑制蛋白和凋亡促進蛋白，研究表明下調Mcl-1或(和)上調Bax可以引起腫瘤細胞凋亡[12-13]。此外，Bcl-2家族成員可通過線粒體內外膜上的蛋白間接或直接影響線粒體途徑凋亡的發生，并激活caspase家族，產生caspase級聯反應執行細胞凋亡[14]；而caspase-3/7是caspase家族中的主要凋亡執行者，其活化是凋亡進入不可逆階段的標志。本研究發現，拉帕替尼可顯著下調Mcl-1蛋白的表達，并增加促凋亡蛋白Bax的表達，同時激活caspase-3/7，共同促進細胞凋亡的發生。

綜上所述，本研究結果顯示，拉帕替尼能顯著抑制CNE-2Z細胞增殖，并誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡，細胞周期相關分子Cyclin D1、P21和P53以及細胞凋亡調控蛋白Bax和Mcl-1均可能參與了上述過程，該結果為拉帕替尼臨床治療鼻咽癌提供了一定的理論基礎和實驗依據。

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Lapatinib induced cell cycle arrest and apoptosis in CNE-2Z cells

TU Yan-hong1, LI Na2, GAO Shi-xiu1, XIAO He2, SONG Ruo-hui1*1Department of Otorhinolaryngology, First Hospital Affiliated to Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031, China
2Institute of Basic Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: song_0515@126.com

, E-mail: song_0515@126.com
This work was supported by the Fund of Anhui "Twelfth Five-Year" TCM Clinical Academic and Technological Lead Talents Training (2011-539)

ObjectiveTo explore the effect of lapatinib on the cell cycle and apoptosis of human CNE-2Z nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells, and to study the related mechanisms. Methods CCK-8 assay was used to assess the proliferation of CNE-2Z cells treated by lapatinib. After PI staining, the cell cycle distribution was determined by flow cytometry. Apoptosis was analyzed using Annexin V/PI double binding assay. The mRNA expression of cell cycle related molecular Cyclin D1, P21 and P53 was assessed with real time PCR. The expression of protein Cyclin D1, P21, P53, and apoptosis related protein Mcl-1 and Bax was determined by Western blotting. The enzymatic activity of caspase-3/7 was measured by using Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit. Results Lapatinib inhibited the proliferation of CNE-2Z cells in a dose-dependent manner. Various concentrations of lapatinib induced significant G0/G1phase arrest and promoted apoptosis of CNE-2Z cells. Lapatinib significantly down-regulated Cyclin D1 expression, but up-regulated P21 and P53 expression at mRNA and protein levels. Lapatinib also induced down-regulation of Mcl-1 with up-regulation of Bax protein expression, and activated Caspase-3/7 in CNE-2Z cells. Conclusion Lapatinib may effectively inhibit proliferation, induce cell cycle arrest and promote apoptosis of CNE-2Z cells, so it may serve as a potent therapeutic agent against nasopharyngeal carcinoma.

lapatinib; nasopharyngeal carcinoma; cell cycle; apoptosis

R739.6

A

0577-7402(2015)07-0568-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.11

2015-03-11；

2015-05-07)

(責任編輯：李恩江)

安徽省“十二五”中醫臨床學術和技術帶頭人才培養對象基金(2011-539)

屠彥紅，醫學碩士。主要從事鼻、咽喉疾病的中西醫結合治療

230031 合肥 安徽中醫藥大學第一附屬醫院耳鼻喉科(屠彥紅、高士秀、宋若會)；100850 北京 軍事醫學科學院基礎醫學研究所(李娜、肖鶴)

宋若會，E-mail:song_0515@126.com