T-cadherin在肝細胞癌中的表達及其與腫瘤復發轉移的關系

李東良，張志強，陳少華，張世安，方堅，林小欽，張霞，江藝

·臨床研究·

T-cadherin在肝細胞癌中的表達及其與腫瘤復發轉移的關系

李東良，張志強，陳少華，張世安，方堅，林小欽，張霞，江藝

目的 探討T-鈣黏附蛋白(T-cadherin)在肝細胞癌中的表達及其與腫瘤侵襲轉移的關系。方法 收集2010年5月－2011年10月于南京軍區福州總醫院行手術切除的肝癌患者的新鮮癌組織和癌旁2cm以上肝組織標本，采用免疫組織化學方法觀察不同惡性生物學程度以及手術前TNM分期相同，術后1年內出現或未出現復發和(或)轉移的HCC患者的癌組織及癌旁組織中T-cadherin基因的表達；采用RT-PCR方法檢測T-cadherin基因mRNA的表達情況。結果 肝癌組織中T-cadherin的異常表達率高達46.7%(28/60)，明顯高于癌旁肝組織6.7%(4/60)，兩組相比差異具有統計學意義(χ2=24.55，P=0.000)。在高分化與中低分化的HCC患者癌組織中T-cadherin的異常表達率分別為30.0%(6/20) 和35.0%(7/20)，兩者比較差異無統計學意義(χ2=0.114，P=0.736)。在出現轉移的HCC患者癌組織中T-cadherin的異常表達率[75%(15/20)]明顯升高，與未出現轉移的HCC患者[32.5%(13/40)]相比，差異具有統計學意義(χ2=9.676，P=0.002)。T-cadherin mRNA檢測結果顯示癌組織T-cadherin表達缺失(高度異常表達)，癌旁組織在多數患者中呈正常表達(T-cadherin陽性)。結論 T-cadherin基因在HCC中異常表達，且與肝細胞癌的復發轉移密切相關，有可能作為判斷HCC預后的預測指標和藥物研究靶點。

癌，肝細胞；鈣黏著糖蛋白類；復發；腫瘤轉移

肝癌是一種隱匿性疾病，一些患者在初次診斷時就已經發生了廣泛的浸潤或轉移，即便還有手術切除機會的患者，術后復發和轉移的發生率也較高[1]。針對腫瘤復發、轉移的預防和治療已成為延長患者生存時間的關鍵因素[2-5]。腫瘤細胞脫離原發病灶、運動能力增強是腫瘤發生轉移的先決條件。細胞黏附分子是介導細胞與細胞或細胞與細胞外基質相互聯系和結合的一類糖蛋白分子，上皮鈣黏附蛋白(truncated-cadherin，T-cadherin)是一種新的非經典黏附分子，以糖基磷脂酰肌醇分子附著于細胞膜上，調節鈣介導的細胞黏附、細胞極性并參與細胞間的識別和信號傳導等作用[6-7]。有研究表明在缺失T-cadherin的黑色素瘤中使其再表達可抑制瘤細胞的生長及侵襲運動能力[8]。也有研究顯示，原發性肝癌(HCC)中的T-cadherin異常表達[9]，但T-cadherin與HCC復發和轉移的關系尚不明確。本研究探討T-cadherin基因在肝細胞癌中的表達及其與肝癌惡性分化、侵襲和轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 材料及分組 收集2010年5月至2011年10月于南京軍區福州總醫院行手術切除的肝癌患者的新鮮癌組織和癌旁2cm以上肝組織標本，標記后置于液氮罐中速凍，–80℃低溫冰箱保存。一部分標本提取基因組，用于RT-PCR檢測T-cadherin mRNA的表達，另一部分標本用4%甲醛固定，制備石蠟切塊。共選取石蠟組織標本60份，其中在1年隨訪期間發生復發和(或)轉移的HCC患者20例，未發生復發和(或)轉移的40例(高分化與中低分化各20例)。兩組患者術前腫瘤TNM分期無差異。觀察T-cadherin在兩組患者癌及癌旁組織中的表達差異。所有患者術前均未接受介入栓塞化療及其他治療。

1.2 T-cadherin mRNA表達檢測 取約50mg冰凍癌組織或癌旁組織，加入1ml Trizo1(Gibco公司)，充分勻漿后按照說明書步驟提取總RNA，按反轉錄試劑盒(Promega公司)說明書反轉錄合成cDNA，進行熒光定量RT-PCR反應。PCR擴增所需引物序列見表1。PCR反應條件為：94℃ 5min，57℃ 30s，72℃30s，擴增40個循環。

1.3 免疫組化法檢測T-cadherin的定位及表達 臨床手術切除標本用常規4%甲醛固定，石蠟包埋，制成3μm連續切片并脫蠟、脫水；置于微波爐內抗原熱修復90s暴露抗原；3%H2O2室溫下孵育10min阻斷內源性過氧化物酶活性；室溫下置于0.05% Tween20 (pH7.0)中10min；滴加兔抗人T-cadherin單克隆抗體(1:150，美國Gibco公司)，室溫下1h；PBS沖洗3min×3；再次放入0.05% Tween 20 (pH7.0)中，室溫放置2h；滴加增強劑20min；加羊抗兔二抗(美國Gibco公司)，室溫下放置30min；PBS沖洗，DBA顯色劑顯色5～20min；蘇木精復染，飽和碳酸鋰30s，95%～100%乙醇脫水，吹干，封固，鏡下觀察并拍照。以PBS代替一抗作為陰性對照進行同步染色。T-cadherin陽性產物主要分布在正常肝組織的肝細胞膜上，為粗細一致的棕黃色顆粒，在細胞質中可有微量表達，在細胞核內無表達。判斷標準按Maruyama等[7]的方法，高倍鏡(×400)下每個視野計數100個細胞，每張切片數5個視野。觀察T-cadherin的定位。細胞膜陽性表達＜5%為陰性(–)，5%～24%為弱陽性(+)，25%～50%為陽性()，＞50%為強陽性()。當細胞膜上陰性及弱陽性表達和(或)出現胞質陽性表達＞10%及細胞核陽性表達時均判定為異常表達。

表1 PCR反應引物序列Tab.1 The primer sequences of the target genes

2 結 果

2.1 T-cadherin mRNA在肝癌組織和癌旁組織中的表達 RT-PCR檢測結果顯示，高分化(A)和中低分化(B)癌旁肝組織T-cadherin mRNA均呈強陽性表達，而癌組織T-cadherin mRNA表達缺失。復發轉移患者(C)不僅癌組織T-cadherin mRNA表達均呈陰性，且半數患者癌旁組織T-cadherin mRNA表達也呈陰性(圖1)。

圖1 RT-PCR檢測T-cadherin mRNA的表達Fig.1 Expression of T-cadherin mRNA determined by RT-PCR

2.2 T-cadherin蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達 免疫組化結果顯示，癌旁組織中T-cadherin蛋白主要在細胞膜上表達，陽性表達率為93.3%(56/60)，缺失及異常表達較少見，僅占6.7%(4/60)；肝癌組織中細胞膜T-cadherin陽性表達率降低，為53.3%(32/60)，缺失和異常表達明顯升高，占46.7%(28/60)。與癌旁組織相比，癌組織細胞膜T-cadherin異常表達，差異具有統計學意義(χ2=24.545，P=0.000，圖2)。

圖2 免疫組化檢測T-cadherin在癌組織和癌旁組織中的表達(DBA顯色)Fig.2 Expression of T-cadherin in cancer tissue and canceradjacent tissue determined by immunohistochemistry (DBA)

2.3 T-cadherin在高分化與中低分化HCC患者癌組織中的表達 兩組患者癌組織中T-cadherin細胞膜表達均減弱或消失，部分癌組織可見胞質表達。高分化及中低分化HCC患者T-cadherin異常表達率分別為30.0%(6/20)和35.0%(7/20)，兩組比較差異無統計學意義(χ2=0.114，P=0.736)。

2.4 T-cadherin在出現或未出現復發和(或)轉移患者癌組織中的表達 在出現復發和(或)轉移患者癌組織中，T-cadherin的缺失和異常表達率高達75.0%(15/20)，在未出現復發和(或)轉移患者中，T-cadherin的缺失和異常表達率為32.5%(13/40)，其中高分化組3 0.0%(6/2 0)，中低分化組為35.0%(7/20)。發生復發和(或)轉移組與未發生復發和(或)轉移組相比兩組差異具有統計學意義(χ2=9.676，P=0.002)。

3 討 論

T-cadherin是近年來新發現的一個細胞黏附分子，為cadherin超家族中的重要一員[7]，與經典的黏附分子的主要區別在于經典cadherin分子由細胞外鈣結合區及跨膜區兩部分組成，而非經典的黏附分子缺少跨膜區而以糖基磷脂酰肌醇分子附著于細胞膜上，故而命名truncated-cadherin，即T-cadherin(又稱CDH13或H-cadherin)。T-cadherin定位于染色體16q24，其cDNA包含一個含714個氨基酸的開放讀碼框，全長約3842bp[6,10]。T-cadherin有調節鈣介導的細胞黏附、細胞形態形成、細胞間識別和信號傳導等作用[11]。

近年來已陸續有關T-cadherin在肝癌[9]、結直腸癌[12]、膽囊癌[13]、鱗狀上皮細胞癌[14]、膀胱移行細胞癌[15]等出現不同程度異常表達的報道，提示其可能對上皮細胞類型的腫瘤有抑制作用，從而在腫瘤發生過程中扮演重要角色。Chan[9]報道T-cadherin基因在肝細胞癌中的表達下降，能誘導肝癌細胞停滯在G2/M期，被認為是肝癌中的關鍵抑癌基因。

本研究收集HCC切除標本，通過RT-PCR方法和免疫組織化學方法對比觀察T-cadherin在癌組織與癌旁肝組織，高分化與中低分化肝細胞癌及出現復發和(或)轉移與未發生復發和/或轉移的原發性肝癌患者癌組織中的表達，結果顯示T-cadherin基因在癌組織異常表達率較高，而多數患者癌旁組織T-cadherin仍表達正常，進一步證實T-cadherin失活或表達下降在肝癌的發生和發展中可能發揮著一定作用。另外，T-cadherin與肝細胞癌復發和(或)轉移的相關性研究較少，本研究還探討了T-cadherin異常表達與肝癌復發、轉移的關系，結果顯示發生復發和(或)轉移的HCC患者癌組織T-cadherin的異常表達明顯高于未發生復發和(或)轉移的患者，提示T-cadherin可能在肝癌的復發和轉移中也發揮著重要的生物學作用。

本研究結果再次證實T-cadherin與腫瘤的發生、發展有著密切聯系。T-cadherin作為細胞黏附分子cadherin超家族成員之一，在人類癌細胞中表達下調，其下調機制與T-cadherin基因啟動子甲基化有明顯關系。T-cadherin還是一種新的血管生成調節因子，研究表明該分子或許可作為調節異常新生血管生成的治療性靶點加以開發，以阻止腫瘤新生血管生成的病理過程[16]。檢測T-cadherin在腫瘤中的表達情況對指導臨床分期以及評價腫瘤預后等有重要意義，對其進一步的深入研究可為腫瘤的診斷和治療帶來新的契機。由于在人類惡性腫瘤中普遍發現的異常甲基化能導致鈣黏蛋白介導的細胞黏附系統失活，因此，T-cadherin異常甲基化的檢測或許可作為臨床篩選高危患者復發或預后的標記而得以應用。

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Expression of T-cadherin in hepatocellular carcinoma and its relationship with relapse and metastasis of tumor

LI Dong-liang1, ZHANG Zhi-qiang1, CHEN Shao-hua2, ZHANG Shi-an1, FANG Jian1, LIN Xiao-qin3, ZHANG Xia1, JIANG Yi21Department of Hepatobiliary Medicine,2Department of Hepatobiliary Surgery, Fuzhou General Hospital of Nanjing Command, Fuzhou 350025, China
3Mengchao Hepatobiliary Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China
This work was supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province (2012J01399) and Fuzhou Science and Technology Plan Project (2012-S-157-2)

ObjectiveTo investigate the expression of T-cadherin in hepatocellular carcinoma and its relationship with tumor relapse and metastasis.MethodsThe gene expressions of T-cadherin in hepatocellular carcinoma tissue with different malignancy grades and its matched adjacent tissues were assessed by immunohistochemistry. The samples were obtained from patients both with relapse and/or metastasis, without relapse, and without metastasis within one year post-operation, and they were in the same TNM stage before operation. The mRNA expression of T-cadherin in hepatocellular carcinoma and matched adjacent tissues was assessed by RT-PCR.ResultsThe abnormal expression rate of T-cadherin in hepatocellular carcinoma was 46.67% (28/60), which was significantly higher than that of the adjacent tissue (6.67%, 4/60, χ2=24.55, P=0.000). No difference was observed in the expression of T-cadherin between well-differentiated and poorly differentiated hepatocellular carcinoma tissues (30% vs 35%, χ2=0.114, P=0.736). The abnormal expression rate of T-cadherin in hepatocellular carcinoma in the patients with metastasis elevated to 75% (15/20), while it was remarkably lower in 32.5% (13/40) of the patients who had no metastasis (χ2=9.676, P=0.002). The RT-PCR results showed that the mRNA expression of T-cadherin in hepatocellular carcinoma significantly decreased compared with that of its adjacent tissues.ConclusionsThere is an abnormal expression of T-cadherin in hepatocellular carcinoma, and it is found to be closely correlated to the tumor recurrence and metastasis. Abnormal expression of T-cadherin in hepatocellular carcinoma may be used as a prognostic indicator and drug research target.

carcinoma, hepatocellular; cadherins; recurrence; neoplasm metastasis

R735.7

A

0577-7402(2015)04-0315-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.04.12

2014-12-25；

2015-02-28)

(責任編輯：熊曉然)

福建省自然科學基金(2012J01399)，福州市科技計劃項目(2012-S-157-2)

李東良，醫學博士，主任醫師，教授。主要從事肝膽疾病的基礎與臨床研究

350025 福州 南京軍區福州總醫院肝膽內科(李東良、張志強、張世安、方堅、張霞)，肝膽外科(陳少華、江藝)；350108 福州 福建醫科大學孟超肝膽醫院(林小欽)