一個脊髓小腦共濟失調家系的分子遺傳學研究

吳丹丹，劉小璇，劉建元，劉勇，陶襄萍，楊樹廣，樊東升，劉少君

一個脊髓小腦共濟失調家系的分子遺傳學研究

吳丹丹，劉小璇，劉建元，劉勇，陶襄萍，楊樹廣，樊東升，劉少君

目的研究1個漢族脊髓小腦共濟失調(SCAs)家系的基因分型。方法收集該SCAs家系中的6例患者和有血緣關系的40例無癥狀者共46人的外周血樣品，結合先證者的臨床體征及二代測序結果，采用多聚酶鏈式反應(PCR)對該家系致病基因ATXN2的CAG三核苷酸重復片段進行擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳和PCR產物測序的方法確定該家系所有成員的正常與異常擴增等位基因內三核苷酸重復次數。結果該家系的遺傳性SCAs為常染色體顯性遺傳，4代46人中有6例SCA2患者，7例為致病等位基因攜帶者。患者ATXN2兩個等位基因中的1條CAG三核苷酸重復次數在正常范圍內，另1條CAG三核苷酸重復次數在異常范圍?；颊弋惓５任换駽AG三核苷酸重復次數范圍為40～46次。結論該家系為CAG三核苷酸重復序列動態突變引起的常染色體顯性遺傳性脊髓小腦共濟失調Ⅱ型，基因診斷還發現該家系中有7名致病等位基因攜帶者。

脊髓小腦共濟失調；三核苷酸重復；動態突變；基因診斷

脊髓小腦共濟失調(spinocerebellar ataxias，SCAs)是一大類由遺傳因素引起的遲發型神經系統退行性病變，占神經系統遺傳性疾病的10%～15%，具有高度的臨床和遺傳異質性[1-2]。該病是由三核苷酸或五核苷酸動態突變擴展引起的，多呈常染色體顯性遺傳，其病理改變主要是脊髓、小腦和腦干的神經元變性脫失與膠質增生[2-3]，臨床表現為小腦共濟失調伴構音障礙、意向性震顫、錐體系及錐體外系癥狀等[4]。根據其臨床特點與基因定位可分為SCA1－30共30種亞型[5]。該病雖病情進展緩慢，但呈進行性惡化與遺傳早現現象，嚴重危害患者健康，給家庭和社會帶來沉重負擔。本研究收集到1個甘肅地區漢族遺傳性脊髓小腦共濟失調家系并進行研究，對先證者進行核磁共振掃描及肌電圖檢查，結合臨床癥狀，確診為脊髓小腦共濟失調，但亞型無法確定。取先證者及其弟弟的外周血進行外顯子測序，獲得與該病相關的突變基因ATXN2，應用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增ATXN2基因，結果發現該家系中6例患者及7例致病等位基因攜帶者的ATXN2基因中包含1條異常等位基因，異常等位基因內的CAG異常擴增，而家系內其他成員ATXN2基因的CAG重復均在正常范圍內。

1 資料與方法

1.1 家系調查 本家系收集自甘肅地區，家系成員5代77人，其中5人因該病去世。家系第一代由于年代久遠且都已去世，詳細資料無法收集。剩余成員中有6例患者，患者均有不同程度的小腦共濟失調癥狀，其他人表現正常。在得到軍事醫學科學院倫理委員會同意并征得家系成員知情同意的情況下，采集家系成員46人的外周血各4ml，凍存于本實驗室超低溫冰箱內備用。

1.2 疾病診斷 先證者于2014年年初在甘肅省臨夏州人民醫院接受核磁共振檢查，隨后在北京大學第三醫院進行了臨床體征檢查與肌電圖檢查。

1.3 致病基因檢測

1.3.1 外顯子捕獲及二代測序 將先證者及其弟弟外周血各200μl送華大基因進行外顯子測序，測序平臺為HiSeq 2000，獲得與該家系疾病相關的突變基因。

1.3.2 基因組DNA提取 使用天根生物科技公司的血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取家系成員血液基因組DNA，用作PCR反應模板。

1.3.3 PCR擴增ATXN2基因 對于華大基因外顯子測序所獲與該家系疾病相關的突變基因ATXN2，使用Primer Premier 5.0設計引物，正向引物為5'-ACGCCACCACAGCCTCCAGAC-3'，反向引物為5'-CTCGCCTCCCTCCGCCTCAG-3'，送至生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系：總體積50μl，TaKaRa PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl，上下游引物(20μmol/L)各1μl，基因組DNA 2μl，雙蒸水21μl。PCR反應條件：95℃ 5min預變性；98℃ 20s變性、66℃ 15s退火、72℃ 60s延伸，38個循環；72℃ 7min。PCR產物片段大小為965bp。

1.4 致病基因ATXN2內CAG三核苷酸重復次數的確定 對1.3中的PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用天根生物科技公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(普通離心柱型)對目的條帶進行切膠回收，將回收后的DNA送至生工生物工程有限公司進行雙向測序，比對測序結果，計數CAG三核苷酸重復次數。

2 結 果

2.1 家系分析及臨床診斷

2.1.1 家系分析 調查發現該家系共5代77人，在世成員中有6例患者，發病年齡20～40歲，患者均有不同程度的小腦共濟失調癥狀。該家系中無近親婚配史，5代中均有患者，男女均可患病，患者的雙親之一必定為患者，符合常染色體顯性遺傳性疾病的遺傳特點(圖1)。

圖1 甘肅地區脊髓小腦共濟失調家系系譜圖Fig.1 The pedigree diagram of the family with spinocerebellar ataxias in Gansu

2.1.2 臨床診斷 先證者，Ⅲ-7，38歲發病，發病7年?；颊?年前無明顯誘因出現行走不穩伴持物不穩，雙下肢發僵，進食嗆咳，并逐漸加重，其余無異常。臨床體征：雙上肢震顫，雙下肢發抖，行走不穩。神經系統檢查：輕度構音障礙，指鼻及跟-膝-脛試驗欠穩妥，輪替障礙，辨距不良。肌電圖檢查：雙上肢和下肢深感覺傳導路徑阻滯，雙側聽覺-腦干徑路波幅下降，雙側視覺徑路波幅下降，四肢肌張力下降，腱反射減弱。頭部核磁掃描顯示：小腦和腦干萎縮，以小腦萎縮為著(圖2)。結合以上資料，確診先證者患有脊髓小腦共濟失調。

2.2 致病基因檢測

圖2 先證者頭顱MRI掃描(箭頭示意腦萎縮部位)Fig.2 Brain MRI images of proband (arrows point to the brain atrophy) A. Sagittal scanning; B. Axial scanning

2.2.1 外顯子捕獲及二代測序 在華大基因測序的兩位患者外顯子測序結果與人類基因組參考序列(UCSC hg 19 version)比對，兩位患者相同的突變為84個點突變位點和8個插入缺失突變基因。結合臨床診斷結果，首先選取8個插入缺失突變基因中的ATXN2基因進行PCR驗證。

2.2.2 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測 對46位家系成員進行了突變基因ATXN2的檢測，結果發現家系中的6例患者Ⅱ-8、Ⅲ-5、Ⅲ-7、Ⅲ-21、Ⅳ-8、Ⅳ-10及7例致病等位基因攜帶者Ⅲ-13、Ⅳ-1、Ⅳ-6、Ⅳ-19、Ⅴ-1、Ⅴ-3、Ⅴ-5的PCR產物電泳圖出現明顯的2條大小不等的條帶，而家系中其他成員未出現該現象。這是因為理論上針對這一位點而言，每個個體PCR產物都是兩個條帶(一對等位基因)，正常人兩條等位基因的CAG重復次數相同或者差距較小，在電泳圖上無法區分，但是患者和攜帶者的PCR產物的正常等位基因明顯比異常等位基因小，在電泳圖上可分辨出來。對PCR擴增后的條帶切膠回收DNA，送至生工生物工程有限公司進行雙向測序。

2.2.3 比對計數CAG重復序列擴增次數 回收后的DNA片段采取ATXN2雙向測序，根據測序結果計數致病基因ATXN2的CAG(反向為CTG)三核苷酸重復次數(圖3、4)，結果顯示患者及致病等位基因攜帶者異常等位基因的CAG重復次數為40～48次，明顯超出正常范圍(表1、2)，剩余家系成員ATXN2兩條等位基因的CAG重復次數均在19～25次，屬于正常范圍。

表1 患者CAG重復次數Tab. 1 The CAG repeats of patients

表2 異常等位基因攜帶者CAG重復次數Tab. 2 The CAG repeats of pathogenic allele carriers

圖3 正常對照Ⅱ-10 PCR產物測序結果Fig. 3 Sequencing result of the PCR products of normal control Ⅱ-10

圖4 患者Ⅱ-8 PCR產物測序結果Fig. 4 Sequencing result of the PCR products of patient Ⅱ-8

3 討 論

SCAs是一大類具有高度臨床和遺傳異質性的神經系統進展性退行性病變，以小腦共濟失調，構音障礙，眼球震顫，認知障礙，錐體系及錐體外系、脊髓及外周神經系統受累為特征[6]，其主要病理改變是神經元變性脫失和神經纖維的沃勒變性[7]。目前已有30多種SCAs亞型的致病基因被定位，其中SCA1、SCA2、SCA3/MJD、SCA6、SCA7、SCA17及齒狀核-紅核-蒼白球路易體萎縮(dentatorubralpallidoluy-sian atrophy，DRPLA)這7種亞型是由于致病基因編碼區內的CAG三核苷酸重復擴增使其編碼的多聚谷氨酰胺鏈異常擴展而引起的[8]。有研究表明，SCAs中的CAG三核苷酸重復擴增可導致中樞神經系統核包涵體形成，有可能是引發SCAs疾病的原因[9]。

SCA2是在古巴最早被發現并描述的，且在古巴的發病率較高[10]，在中國則較少見[11]。SCA2患者多在30～40歲發病[12]，病程進展緩慢，臨床表現以小腦共濟失調、構音障礙、眼肌麻痹、慢眼動、腱反射減弱、早期周圍神經病變等癥狀為主，常伴智力障礙，頭部MRI檢查顯示不同程度的橄欖-腦橋-小腦萎縮[13]。SCA2患者的病理損傷主要存在于小腦皮質的浦肯野細胞和腦干神經元，還存在于大腦皮質的額葉和枕葉以及肌肉組織[7]。

ATXN2是SCA2的致病基因，最先被德國的Gispert與Twells在1993年定位于12q23-24.1[14]，由Pulst 等[15]在1996年成功克隆。ATXN2基因編碼Ataxin-2蛋白，相對分子質量約為140×103，含1312個氨基酸殘基，第1外顯子編碼區CAG三核苷酸異常重復擴展導致編碼蛋白中的多聚谷氨酰胺鏈延長而致病[16]。正常ATXN2等位基因CAG三核苷酸重復次數為13～31次，而異常等位基因重復次數大于34次，多數在36～59次之間，且序列中沒有CAA插入[15]，中間重復范圍為32～34次[17]。

本研究的家系先證者以軀干共濟失調起病，隨后出現姿勢性震顫，運動神經正常，感覺神經的雙側尺神經和一側腓神經未測出，雙側聽覺-腦干徑路波幅下降，雙側視覺徑路波幅下降，有顱腦神經損傷，無明顯慢眼動，無明顯周圍神經病變，小腦系癥狀有構音障礙、眼肌麻痹、軀干共濟失調、姿勢性震顫等，錐體外系癥狀有鉛管樣肌張力增高、靜止性震顫等。該先證者的癥狀基本符合SCA2的表現，但其家系成員均無智力障礙。基因診斷方面，患者與正常人CAG三核苷酸重復均被CAA打斷，CAA 與CAG一樣編碼谷氨酰胺，但有報道CAA插入可能會減輕患者的癥狀[18]，這在本研究中有所體現，CAG重復中CAA插入越多的患者癥狀相對越輕。除此之外，有報道稱患者CAG重復次數越多，則發病年齡越小，病情越嚴重[19]，這在本家系成員中沒有體現，亦未顯出現其他報道中的遺傳早現現象。

本研究所搜集到的家系具有以下特點：①家系龐大，血液樣本采集較全；②所有患者均無智力障礙，表現為智力正常；③SCA2在該家系的不同成員中具有臨床和遺傳異質性；④家系中7例SCA2癥狀前患者異常等位基因CAG重復次數為40～48次，遠遠超出正常人CAG重復13～31次的范圍，可以做出7例為致病等位基因攜帶者的診斷。本研究除了對ATXN2進行PCR檢測驗證外，還對外顯子測序所獲的84個點突變位點和其他7個插入缺失突變基因進行了PCR檢測驗證，結果證實這些突變基因均與該家系疾病無關，說明對于SCA2，ATXN2基因內CAG三核苷酸異常擴展是發病的主要原因。

本研究對于該家系的遺傳性神經系統疾病進行了明確診斷，確診為脊髓小腦共濟失調Ⅱ型，具有重要的理論與現實意義。首先，為家系成員提供了翔實的資料，明確了家系成員攜帶致病基因的情況，為他們的醫療保健提供了參考。其次，如此龐大的SCA2家系在中國乃至世界范圍內都比較少見，該家系成員的臨床體征、核磁共振影像、肌電圖檢查等資料豐富了SCA2的研究。再次，該家系成員的臨床體征結合基因診斷結果，再一次證實了SCAs分型不能僅僅依靠臨床診斷，因為SCAs具有高度的臨床和遺傳異質性，且各亞型之間有重疊癥狀，必須結合基因診斷。

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Molecular genetics of a Chinese family with spinocerebellar ataxia

WU Dan-dan1, LIU Xiao-xuan2, LIU Jian-yuan3, LIU Yong1, TAO Xiang-ping2, YANG Shu-guang1*, FAN Dong-sheng2*, LIU Shao-jun1*1Department of Neurobiology, Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, China
2Department of Neurology,Third Hospital Peking University, Beijing 100191, China
3Department of General Surgery, First People's Hospital of Jiayuguan, Jiayuguan, Gansu 735100, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author. YANG Shu-guang, E-mail: lionamms@hotmail.com; FAN Dong-sheng, E-mail: dsfan@sina.com; LIU Shaojun, E-mail: liusj@bmi.ac.cn

. YANG Shu-guang, E-mail: lionamms@hotmail.com; FAN Dong-sheng, E-mail: dsfan@sina.com; LIU Shaojun, E-mail: liusj@bmi.ac.cn
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81370051, 81471155)

ObjectiveTo study the genotype of the members of a Chinese family with spinocerebellar ataxia (SCA).MethodsThe peripheral blood samples of 6 patients and 40 asymptomatic people belonged to the family were collected. Referring to the clinical manifestations of the proband and second-generation sequencing results, the CAG trinucleotide repeats of the pathogenic gene ATXN2 were amplified by polymerase chain reaction (PCR). The repeated times of the trinucleotide in normally and abnormally amplified alleles were defined by agarose gel electrophoresis and PCR products sequencing.ResultsAutosomal dominant heredity was the cause of the SCA in this family. Six out of 46 in the fourth-generation were SCA2 patients, 7 were the carriers of pathogenic allele. The repeated times of CAG trinucleotide were within the normal range in one of the two alleles of ATXN2, but they were in abnormal range in the another one. The repeated times of CAG trinucleotide were 40-46 in abnormal alleles of patients.ConclusionAutosomal dominant heredity SCA2 has been diagnosed in this family caused by the dynamic nutation of CAG trinucleotide repeats, and 7 pathogenic allele carriers in this family were confirmed by genetic diagnosis.

spinocerebellar ataxias; trinucleotide repeats; dynamic mutation; genetic diagnosis

R744.7

A

0577-7402(2015)08-0638-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.08.07

2015-01-20；

2015-06-28)

(責任編輯：沈寧)

國家自然科學基金(81370051，81471155)

吳丹丹，碩士研究生。主要從事家族性神經系統遺傳疾病的研究

100850 北京 軍事醫學科學院基礎醫學研究所神經生物學實驗室(吳丹丹、劉勇、楊樹廣、劉少君)；100191北京 北京大學第三醫院神經科(劉小璇、陶襄萍、樊東升)；735100 甘肅嘉峪關 嘉峪關市第一人民醫院普外科(劉建元)

楊樹廣，E-mail：lionamms@hotmail.com；樊東升，E-mail：dsfan@sina.com；劉少君，E-mail：liusj@bmi.ac.cn