FTY720對急性脊髓損傷大鼠神經功能及血脊髓屏障的影響

岳妍，譚波濤，劉媛，伍亞民，賈功偉，蔣瑋，虞樂華，殷櫻

FTY720對急性脊髓損傷大鼠神經功能及血脊髓屏障的影響

岳妍，譚波濤，劉媛，伍亞民，賈功偉，蔣瑋，虞樂華，殷櫻

目的 觀察新型免疫抑制劑FTY720對急性脊髓損傷后大鼠神經功能和血脊髓屏障的影響。方法 成年SD大鼠144只，隨機分為4組(n=36)。正常對照組(NG)：不做任何處理；假手術組(SO)：單純咬除椎板暴露脊髓，不予損傷處理；損傷對照組(HS)：脊髓右半側橫切損傷后腹腔注射生理鹽水；FTY720治療組(FTY720)：脊髓右半側橫切損傷后30min給予腹腔注射FTY720[1mg/(kg·d)]，連續7d。術后不同時間點行行為學檢測，包括BBB運動功能評分和水平網格檢測；行神經電生理運動誘發電位(MEP)N1波和感覺誘發電位(SEP) P1波潛伏期檢測；對脊髓組織行蘇木精-伊紅(HE)染色及Evans Blue(EB)血脊髓屏障滲透性檢測。分析FTY720治療效果。結果 半橫切損傷后，HS組和FTY720組大鼠損傷側脊髓神經功能下降，至28d時仍未恢復至NG 組和SO組水平。行為學檢測和神經電生理檢測結果顯示，FTY720組大鼠運動功能恢復速度比HS組更快；損傷7、14、28d時，兩組大鼠BBB評分和SEP P1波潛伏期檢測差異有統計學意義(P<0.05)；損傷14、28d時，兩組大鼠水平網格檢測和MEP N1波潛伏期檢測差異有統計學意義(P<0.05)。組織學檢測結果顯示，各時間點NG 組和SO組大鼠脊髓結構均完整；損傷14d時，FTY720組脊髓損傷處慢性炎癥細胞浸潤，膠質化反應程度小于HS組；損傷28d時，FTY720組損傷處空洞殘存面積小于HS組，再生纖維排列較HS組有序。血脊髓屏障滲透性檢測結果發現，損傷后7d內，HS組和FTY720組大鼠血脊髓屏障EB滲出量較NG組和SO組明顯增加；各時間點FTY720組EB滲出面積均小于HS組(P<0.05)，其中損傷3d時差異最為明顯。結論 FTY720能顯著降低脊髓損傷急性期血脊髓屏障滲透性，有效促進急性期后神經功能的恢復，為損傷組織提供一定的神經保護作用。

免疫抑制劑；FTY720；急性脊髓損傷；神經保護藥

急性脊髓損傷是一類嚴重的中樞神經系統創傷性疾病，可引起脊髓組織內血管破損，神經細胞快速死亡。局部血脊髓屏障(blood-spinal cord barrier，BSCB)結構破壞會引發一系列細胞化學級聯反應，加重損傷程度[1]。因此，促進急性期BSCB結構和功能的修復，對改善局部微環境，降低繼發性損傷程度有重要意義[2]。

FTY720(Fingolimod)是由從冬蟲夏草中提取的免疫相關成分經化學修飾后合成的新型免疫抑制劑，通過結合1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)受體發揮調節作用[3-4]。FTY720因其能功能性拮抗淋巴細胞膜上的1-磷酸鞘氨醇受體1(S1P1)，可在不影響免疫監督的情況下減少外周淋巴細胞對中樞神經系統的浸潤及炎性介質的釋放而被用于多發性硬化癥的臨床治療[5]。近年來許多研究發現，除免疫系統調節作用外，FTY720還能發揮上調腦源性神經營養因子表達、促髓鞘再生等更多的神經保護作用[6-10]。

本研究采用脊髓半橫切損傷模型，觀察FTY720對大鼠急性脊髓損傷后神經功能及BSCB的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級成年SD大鼠144只，雌雄各半，體重220～250g(由第三軍醫大學大坪醫院動物中心提供)。FTY720(美國Selleckchem公司)，Evans Blue(美國Sigma公司)。實驗大鼠隨機分為4組(n=36)。正常對照組(normal control group，NG 組)：不做任何處理；假手術組(sham-operated group，SO組)：單純咬除椎板暴露脊髓，不予損傷處理；損傷對照組(hemisection group，HS組)：制作脊髓右半側橫切損傷模型后腹腔注射生理鹽水；FTY720治療組(FTY720 treated group，FTY720組)：脊髓右半側橫切損傷后腹腔注射FTY720治療。FTY720組大鼠腹腔注射FTY720生理鹽水溶液[1mg/ (kg·d)]，連續7d，首次給藥為術后30min；HS組大鼠按體重每日腹腔注射等量生理鹽水[11-12]。

1.2 脊髓半橫切模型建立 SD大鼠稱重，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40mg/kg)。麻醉大鼠俯臥位固定于手術板上，腰背部脫毛，常規消毒鋪巾。以T10棘突體表標志點為中心行背部正中切口，暴露并小心咬除T9-T11椎板。打開硬脊膜暴露脊髓后以正中動脈為標志，用眼科手術尖刀橫斷T10右半側脊髓，完全切斷并清除殘留的纖維組織。切割時鼠尾痙攣性擺動、右下肢回縮撲動后癱瘓作為造模成功的標志。術后逐層縫合硬脊膜、肌肉、皮膚組織，肌內注射青霉素2萬U(2次/d)抗感染，連續3d[13]。術后各組大鼠分籠常規飼養，根據情況定時膀胱按壓促排尿至自主排尿功能恢復，觀察大鼠飲食及恢復情況。

1.3 檢測指標

1.3.1 行為學檢測 各組大鼠分別于術后1、3、7、14、28d依據改良BBB評分(Basso Beattie Bresnahan locomotor rating scale，BBB)標準進行評分[14]，以反映大鼠損傷側后肢運動功能的恢復情況。7、14、28d時加做水平網格檢測：將大鼠置于1cm×1cm大小的水平網格上自由活動4min，計數損傷側后足踩空的步數與總步數，并計算踩空步數占總行走步數的比例[15]。BBB評分和網格計數均采用雙盲法，由非課題組的經專業訓練的實驗人員負責記錄。檢測前排空大鼠膀胱。

1.3.2 神經電生理檢測 各組大鼠分別于術后7、14、28d采用Powerlab/16SP(澳大利亞，ADI公司)多導生理記錄儀檢測運動誘發電位(MEP)和感覺誘發電位(SEP)。MEP檢測方法：將直徑1mm的銀球電極(刺激電極正極)置于感覺運動皮層區表面，負極置于大鼠下顎，保持濕潤；銀質雙保護電極(記錄電極)置于右側坐骨神經處，正負極相距2mm；參考電極置于椎旁肌處。SEP檢測方法：刺激電極與MEP記錄電極位置相反，刺激電極負極置于顱頂切口右側皮下肌層，保持濕潤；參考電極位置不變[16]。刺激參數：頻率4Hz，波寬0.2ms，強度10～40mV，信號經前置放大器放大10萬倍，計算機疊加256次后進行平均[16]。記錄MEP和SEP的波形曲線并計算MEP N1波和SEP P1波的峰潛時。

1.3.3 組織學檢查 各組大鼠分別于術后14d和28d灌注取材，損傷段脊髓組織置于4%多聚甲醛中充分固定后常規石蠟包埋。行連續橫斷面石蠟切片，切片厚度5μm，標本每隔10張取1張行HE染色。每個標本取5張貼片備用。采用Nikon病理圖像分析采集系統留圖分析。

1.3.4 血脊髓屏障滲透性檢測 各組大鼠分別于術后1、3、7d檢測損傷段脊髓組織內Evans Blue(EB)染液的滲出量。標準曲線的繪制：用二甲基甲酰胺(DMF)配制20μg/ml Evans Blue溶液，全波長掃描測定其光密度(A)值，確定最大吸收峰在635nm波長處。將DMF倍比稀釋配制成20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3175μg/ml濃度的標準液，分別檢測各梯度濃度標準液在635nm處的光密度(A635)值，計算回歸方程，繪制標準曲線。

組織切片及熒光檢測：1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，經股靜脈緩慢推注2.5% Evans Blue生理鹽水溶液(4ml/kg)，持續10s以上，循環30min后灌注取材。稱取損傷段組織濕重后按100mg/3ml的量加入DMF勻漿，37℃避光水浴48h后，離心取上層萃取液檢測A635值，DMF作空白調零。記錄數據，根據標準曲線計算脊髓組織中的EB滲出量(μg/g)。每組另取5個組織于冰凍切片機(CM1900型，德國，Leica公司)上行連續矢狀面冰凍切片，切片厚度20μm，中性樹脂封固后于熒光顯微鏡下550nm激發光下觀察各組大鼠EB滲出情況，并采用Image-Pro Plus 6.0圖片分析軟件對目標區域熒光強度進行半定量分析。

1.4 統計學處理 所有數據使用SPSS 13.0統計軟件進行分析。正態分布的計量數據均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 行為學檢測結果

2.1.1 BBB評分結果 術后1d時，HS組死亡3只，FTY720組死亡2只；3d時，HS組死亡1只，FTY720組死亡1只；5d時，HS組死亡1只，均對各組缺失進行補充。NG組大鼠在各時間點BBB評分為21分；術后7d內，SO組大鼠較NG組大鼠評分有輕度下降，隨后逐漸恢復，7d時與NG組比較差異已無統計學意義(P>0.05)。HS組及FTY720組大鼠損傷后1d，右后肢運動功能基本喪失，3d后評分逐漸上升，FTY720組上升速度大于HS組，7～28d，兩組評分差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.1.2 網格實驗結果 各時間點NG 組和SO組大鼠均可在水平網格上協調活動，后足能抓握于網格間，踩空比例小，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。術后7d內，HS組和FTY720組大鼠網格上協調活動能力差，右后足踩空比例明顯增加；隨著功能的恢復，踩空比例逐漸下降，FTY720組大鼠下降速度大于HS組，術后14d和28d時，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

表1 大鼠不同時間點BBB評分表(n=5，±s)Tab. 1 BBB score of rats evaluated at respective time points (n=5,±s)

表1 大鼠不同時間點BBB評分表(n=5，±s)Tab. 1 BBB score of rats evaluated at respective time points (n=5,±s)

(1)P<0.01 compared with NG group; (2)P<0.01 compared with SO group; (3)P<0.05 compared with HS group

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圖1 大鼠不同時間點網格檢測情況Fig.1 Grid walking test of rats evaluated at respective time points

2.2 神經電生理檢測結果 術后各時間點，NG 組和SO組大鼠MEP的N1波與SEP的P1波潛伏期的差異無統計學意義(P>0.05)；HS組大鼠和FTY720組大鼠損傷側MEP N1波和SEP P1波波幅下降，潛伏期明顯延長；FTY720組大鼠較HS組大鼠MEP N1波及SEP P波潛伏期延長，但幅度小，術后7d兩組P1波潛伏期差異有統計學意義(P<0.05)，術后14d 和28d兩組P1波和N1波潛伏期差異均有統計學意義(P<0.05，表2、3)。

2.3 脊髓組織學檢測結果 NG組及SO組大鼠脊髓組織結構完整，神經細胞胞體分布清楚，胞體間結構排列有序。損傷后14d，HS組大鼠損傷周圍神經組織大面積壞死，大量淋巴細胞和單核細胞浸潤吞噬，壞死組織周圍膠質化反應明顯；FTY720組大鼠神經組織壞死面積小于HS組，炎性細胞浸潤數量較HS組少。損傷后28d，HS組大鼠損傷壞死處由膠質細胞填充，組織結構排列紊亂，灰質殘留較大空腔；FTY720組大鼠灰質殘留空腔較HS組小，組織結構排列較緊密(圖2)。

表2 大鼠不同時間點MEP N1峰潛時檢測表(n=5，±s)Tab. 2 The N1 latency of MEP at respective time points (n=5,±s, ms)

表2 大鼠不同時間點MEP N1峰潛時檢測表(n=5，±s)Tab. 2 The N1 latency of MEP at respective time points (n=5,±s, ms)

(1)P<0.01 compared with NG group, (2)P<0.01 compared with SO group, (3)P<0.05 compared with HS group

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表3 大鼠不同時間點SEP P1峰潛時檢測表(n=5，±s)Tab. 3 The P1 latency of SEP at respective time points (n=5,±s, ms)

表3 大鼠不同時間點SEP P1峰潛時檢測表(n=5，±s)Tab. 3 The P1 latency of SEP at respective time points (n=5,±s, ms)

(1)P<0.01 compared with NG group, (2)P<0.01 compared with SO group, (3)P<0.05 compared with HS group

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圖2 大鼠脊髓組織學觀察結果(HE染色)Fig. 2 Histological results of spinal tissues of rats (HE stainning)

2.4 血脊屏障滲透性檢測結果 術后1、3、7d， NG 組及SO組大鼠脊髓內幾乎無EB滲出，HS組和FTY720組大鼠脊髓EB滲出量明顯增加(P<0.05)；損傷前3d，HS組大鼠脊髓EB滲出量呈上升趨勢，隨后下降，而FTY720組大鼠無上升趨勢，各時間點兩組比較結果差異均有統計學意義(P<0.05，圖3、4，表4)。

圖3 4組大鼠不同時間點Evans Blue滲出量Fig. 3 Diffusion of fluorescent Evans Blue in injured spinal cord tissue of rats at respective time points

表4 大鼠不同時間點損傷段平均熒光強度值比較(n=5，±s)Tab. 4 Mean fluorescence intensity of Evans Blue at respective time points (n=5,±s)

表4 大鼠不同時間點損傷段平均熒光強度值比較(n=5，±s)Tab. 4 Mean fluorescence intensity of Evans Blue at respective time points (n=5,±s)

(1)P<0.01 compared with NG group, (2)P<0.01 compared with SO group, (3)P<0.05 compared with HS group

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圖4 大鼠脊髓損傷處Evans Blue溶液的滲出情況(熒光顯微鏡)Fig. 4 Diffusion of fluorescent Evans Blue in injured spinal cord tissue of rats (Fluorescence microscope)

3 討 論

Norimatsu等[17]通過行為學檢測發現，FTY720在脊髓損傷亞急性早期(損傷后7～14d)對運動功能恢復有促進作用，而Lee等[12]研究認為FTY720對運動功能的影響在亞急性期后(損傷28d后)更為明顯。我們利用行為學指標和神經電生理技術對大鼠脊髓半橫切損傷后患肢功能恢復情況進行檢測發現，半切損傷后7d，FTY720治療組大鼠BBB運動功能評分已大于損傷組，MEP N1波和SEP P1波潛伏期也較損傷組縮短，說明急性期末，經FTY720治療的大鼠損傷側神經傳導束功能已優于未經治療大鼠。亞急性期內，隨著患側肌力增加，患肢運動功能進一步恢復，治療組大鼠運動協調性和抓握能力均明顯改善。急性脊髓損傷后，T細胞在急性期后期反應性浸潤，并以高水平維持到損傷后數周。持續的T細胞水平增高會對脊髓組織內殘存神經元造成進一步損傷[18-19]。然而，有研究發現，FTY720對損傷處T細胞數量的抑制作用在損傷后亞急性期最明顯[17]。本研究也通過HE染色進行了損傷脊髓的組織學觀察，結果顯示，FTY720治療能減輕傷后14d時損傷周圍脊髓組織內淋巴細胞和單核細胞的浸潤，顯著減少神經細胞壞死面積。結合行為學和神經電生理檢測結果，我們推測在損傷急性期內，FTY720還存在其他可能的神經保護效應。

BSCB是調節脊髓正常代謝，維持脊髓內環境穩定的重要結構。急性脊髓損傷后，局部屏障功能直接破壞[20]，損傷周圍脊髓組織暴露于循環中的內源性免疫炎性因子、毒性因子和外源性病原體中。內皮細胞和神經細胞免疫性損傷加重，使得BSCB急性期內持續開放，滲出增加，內環境失衡，從而引起不可逆性損傷[21-23]。研究發現，FTY720能維持葡萄球膜炎中血-眼屏障的完整性，抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)誘導的微血管滲透性增加，并能通過誘導血管內皮鈣黏蛋白和β連環蛋白的整合形成新的內皮間連接，提示其對微血管系統也有調節作用[24-25]。我們利用血脊髓屏障Evans Blue滲出實驗發現，半切損傷后，損傷段脊髓組織內EB滲出量明顯增加，損傷后3d達高峰，急性期后期開始減少，FTY720治療能顯著減少早期EB的滲出，減輕局部水腫，熒光顯微鏡下對組織切片的觀察結果一致。該結果提示，FTY720對創傷性病理條件下的微血管功能也有調節作用。有研究者指出，FTY720能下調損傷早期脊髓神經元上凋亡基因caspase-3的表達水平，發揮抗凋亡作用[26]。但體外實驗發現FTY720并不能增加毒性因子作用下神經元的存活數量[13]。結合本實驗研究結果，我們認為，FTY720可能是通過降低BSCB滲透性，減少炎性因子浸潤和改善局部微循環的方式減少神經細胞的壞死凋亡，進而為神經功能的恢復提供有利因素。免疫抑制劑甲潑尼松龍的使用是目前臨床常采取的治療手段之一，它可以穩定細胞膜，抑制局部出血、水腫、微循環障礙和炎性反應，但使用激素具有治療窗短、劑量需求大、副反應重的限制[27-28]。FTY720為脊髓損傷早期藥物治療提供了新的選擇。我們也將繼續通過對損傷側遠端脊髓運動神經元自發放電檢測等實驗途徑進一步明確FTY720對運動功能的影響。

此外，本實驗HE染色還發現FTY720能有效減輕亞急性期損傷周圍膠質化反應程度。有研究指出，FTY720對反應性星形膠質細胞增生的抑制作用與淋巴細胞抑制機制相同[29-30]。然而，星形膠質細胞是BSCB的重要組成成分，對BSCB結構完整性和物質轉運有重要作用[21]。急性期后，微血管再生和星形膠質細胞增生明顯，因此長期使用FTY720治療是否有利于BSCB結構功能的重建和神經功能的恢復還需進一步研究。

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Effects of FTY720 on neurological function and blood-spinal cord barrier of rats with acute spinal cord injury

YUE Yan1, TAN Bo-tao1, LIU Yuan2, WU Ya-min2, JIA Gong-wei1, JIANG Wei1, YU Le-hua1, YIN Ying1*1Department of Rehabilitation Medicine,Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China
2Third Department of Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
*

, E-mail: yinying@cqmu.edu.cn
This work was supported by the National Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2012jjA10058)

ObjectiveTo investigate the effects of a novel immunomodulator FTY720 (Fingolimod) on nerve function and blood-spinal cord barrier (BSCB) of rats with acute spinal cord injury.MethodsOne hundred and forty-four adult Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups with 36 each: normal control group (NG Group): rats without any treatment; sham-operated group (SO Group): rats' spinal cords were exposed by laminectomy without injury; hemisection group (HS Group): rats underwent spinal cord hemisection followed by intraperitoneal injection of normal saline; FTY720 treatment group (FTY720 Group): rats underwent spinal cord hemisection followed by intraperitoneal injection of FTY720 [1mg/(kg.d)] for 7 days. The neurological function was assessed by Basso Beatlie Bresnahan (BBB) scores, grid walking, N1 and P1 delay of motor evoked potential (MEP) and somatosensory evoked potentials (SEP), histological evaluation with light microscope with HE staining, and determination of blood-spinal cord barrier permeability with EB at different time points after injury.ResultsThe nerve function of rats in HS group and FTY720 group was impaired after hemisection injury without signs of recovery up to Day 28 after damage as compared with NG group or SO group. The recovery of motor function in FTY720 treatment group was earlier than in HS group. The BBB scores, the results of grid walking test, and the latent period of SEP-P1 showed statistically significant difference between FTY720 group and HS group from Day 7 to 28 after injury (P<0.05). Comparing the pathological picture at Day 14 and Day 28 afterinjury, the number of chronic inflammatory cells, the degree of glial cell reaction, and the size of syringomyelia cavities in gray matter in FTY720 group were significantly less than those in HS group. In addition, the leakage of EB from the damaged BSCB increased in HS group and FTY720 group than in NG group and SO group through 7 days after injury (P<0.01), while at each time point the leakage of EB was less in FTY720 group than in HS group (P<0.05), and the most significant difference was observed on Day 3 after injury.ConclusionFTY720 can lower the permeability of blood-spinal cord barrier at acute phase of spinal cord injury, effectively promotes the recovery of nerve function after acute injury phase, and it provides certain potential neuroprotective effects.

immunosuppressive agents; FTY720; spinal cord injuries; neuroprotective agents

R651.2

A

0577-7402(2013)03-0200-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.03.06

2014-11-07；

2015-02-13)

(責任編輯：沈寧)

重慶市自然科學基金計劃項目(cstc2012jjA10058)

岳妍，碩士研究生。主要從事神經康復方面的研究

400010 重慶 重慶醫科大學附屬第二醫院康復醫學科(岳妍、譚波濤、賈功偉、蔣瑋、虞樂華、殷櫻)；400042 重慶第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所三室，創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室(劉媛、伍亞民)

殷櫻，E-mail: yinying@cqmu.edu.cn