細菌特殊結構的染色觀察及實驗室檢驗

王佰雙

摘要：目的 探索細菌特殊結構的染色觀察及實驗室檢驗方法。 方法 在實驗室條件下，取樣本分別采用涂片、干燥固定、染色和加熱等步驟進行檢測。結論 通過光學顯微鏡的觀察，了解細菌芽孢、莢膜和鞭毛染色的原理和意義，學會芽孢、莢膜和鞭毛染色的方法。

關鍵詞：細菌；細菌的染色體；檢驗

細菌（英文：germs；學名：bacteria），是微生物的主要類群之一，屬于細菌域。廣義的細菌即為原核生物是指一大類細胞核無核膜包裹，只存在稱作擬核區（nuclear region）（或擬核）的裸露DNA的原始單細胞生物，包括真細菌（eubacteria）和古生菌（archaea）兩大類群。人們通常所說的即為狹義的細菌，狹義的細菌為原核微生物的一類，是一類形狀細短，結構簡單，多以二分裂方式進行繁殖的原核生物，是在自然界分布最廣、個體數量最多的有機體，是大自然物質循環的主要參與者。細菌的個體非常小，目前已知最小的細菌只有0.2微米長，因此大多只能在顯微鏡下看到它們。細菌一般是單細胞，細胞結構簡單，缺乏細胞核、細胞骨架以及膜狀胞器。

1 檢驗準備

1.1 儀器：普通光學顯微鏡、超凈工作臺、恒溫培養箱。

1.2 實驗菌：枯草芽孢桿菌，為24～48h營養瓊脂培養物；腸膜狀明串珠菌，為24h營養瓊脂培養。

1.3 普通變形桿菌：為營養瓊脂培養基（瓊脂用量0.8%）連續轉接培養4～5代，每代

培養18～22h。

1.4 染色液：無菌水（10mL分裝于試管中）、孔雀綠染色液、沙黃染色液、結晶紫染色液、20%硫。

酸銅溶液、95%乙醇溶液、硝酸銀染色液。

1.5 其他：香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、載玻片、蓋玻片、酒精燈、接種環、鑷子、燒杯、玻璃棒。

2 細菌原理：

2.1 芽孢：

芽孢是某些細菌生長到一定階段后在菌體內形成的休眠體，通常呈圓形或橢圓形。細

菌能否形成芽孢以及芽孢的形狀、芽孢在芽孢囊內的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鑒

定細菌的依據之一。

芽孢具有厚而致密的壁，通透性低，對各種不利因素如高溫、冷凍、射線、干燥、化

學藥品和染料等具有很強的抵抗力。

芽孢染色法是根據芽孢具有難以染色而一旦染色后又難以脫色的特點而設計的，所以

芽孢染色法都基于同一原則：選用著色力強的染料進行染色。

2.2 芽孢染色法的操作步驟為：

涂片——在潔凈的載玻片中央加一小滴無菌水，用滅菌的接種環取少許枯草芽孢桿菌置于水滴中并和水滴充分混勻，并涂成極薄的菌膜。

干燥固定——涂片在空氣中干燥后，手持載玻片一端，有菌膜一面向上，通過酒精燈的微火三次。注意用手指觸摸載玻片反面，以不燙手為宜。冷卻。

染色和加熱——在涂菌處滴加孔雀綠染色液，并在微火上加熱至染料冒蒸汽開始計時，加熱染色l0min。注意加熱時要不斷補充孑L雀綠染色液，以免燒干。

水洗——傾去染色液，冷卻后用水沖洗。

復染——用沙黃染色液染色1min。

水洗、干燥、鏡檢——結果：芽孢被染成綠色，營養體呈紅色。

2.3 莢膜：

莢膜是包圍在某些細菌細胞外的一層黏液狀或膠質狀的物質，其成分為多糖、糖蛋白或多肽。莢膜與染料的親和力弱，不易著色，再有莢膜物質溶于水，用水沖洗時易被除去。

Anthony染色法是先以結晶紫作為初染劑，加于未經加熱固定的菌膜上，菌體和莢膜均被染成深藍紫色，然后用20%硫酸銅溶液為脫色劑。

2.4 莢膜Anthony染色法的操作步驟：

涂片——在潔凈的載玻片的一端加2～3滴結晶紫染色液，用滅菌的接種環取l環菌與玻片上的結晶紫染色液充分混勻。用一塊潔凈的載玻片的窄邊將混勻的菌液刮開涂成極薄的菌膜，放置5～7min。

干燥——在空氣中自然干燥。注意切勿用酒精燈加熱。

脫色——用20%硫酸銅溶液沖洗脫色后，在空氣中干燥或用吸水紙吸干。

鏡檢——結果：莢膜淺藍色或灰白色，菌體深藍紫色。

2.5 鞭毛：

細菌的鞭毛很細，直徑為10～20nm，用電子顯微鏡可以清楚觀察到。但是若采用特殊染色方法使鞭毛加粗，在普通光學顯微鏡下也可以看到鞭毛。鞭毛染色方法很多。本實驗采用銀染法進行鞭毛染色。

2.6 銀染法進行鞭毛染色的操作步驟：

載玻片清洗——選擇新的光滑無劃痕的載玻片，浸泡于洗潔精充分溶解的水中，煮沸20min，稍冷后取出用自來水沖洗干凈并瀝干，然后浸泡于95%乙醇溶液中。用時取出，在酒精燈火焰上燒去酒精后即可使用。

菌液制備——將分裝于試管中的無菌水緩慢地倒人經4～5代轉接培養的斜面培養物中，不要搖動試管，讓菌體在水中自行擴散。注意蒸餾水預先在恒溫培養箱中保溫，使之于與菌種同溫。置于恒溫培養箱中保溫10min。目的是讓沒有鞭毛的老菌體下沉，而具有鞭毛的菌體在水中松開鞭毛。

涂片——用吸管從菌液上端吸取菌液于潔凈的載玻片一端，稍稍傾斜玻片，使菌液緩慢地流向另一端。

干燥——在空氣中自然干燥。

染色——滴加硝酸銀染色液A液，染色4～6min；用蒸餾水輕輕地充分洗凈A液。用B液沖去殘水，再加硝酸銀染色液8液于玻片上。用酒精燈微火加熱至有蒸汽冒出，維持1mm左右。注意加熱時應隨時補充B液，不可使玻上B液蒸干。用蒸餾水沖洗，干燥。

鏡檢——結果：菌體和鞭毛呈深褐色至黑色。

3 檢驗步驟：

對枯草芽孢桿菌進行芽孢染色，鏡檢，并繪圖和描述菌體、芽孢特征。

對腸膜狀明串珠菌進行莢膜染色，鏡檢，并繪圖和描述菌體、莢膜特征。

對普通變形桿菌進行鞭毛染色，鏡檢，并描述鞭毛著生方式。

4 檢驗結果

通過光學顯微鏡的觀察，了解細菌芽孢、莢膜和鞭毛染色的原理和意義，學會芽孢、莢膜和鞭毛染色的方法。

參考文獻

[1] 陳菊滟，陳文娟，趙桂芳. 教學用細菌染色方法的改進. 微生物學通報， 1999，26，02.

[2] 姚文琴，劉曉焱.兩種改良芽胞染色法染色效果觀察.檢驗醫學與臨床， 2008， 5，07.

[3] 葉生梅，高威.細菌芽胞染色方法改進研究.微生物學雜志， 2011， 31，01.