甜瓜種子中種傳病毒的RT—PCR檢測

彭斌 汪麗剛 古勤生

摘 要： 為了建立葫蘆科作物干種子主要種傳病毒檢測方法，在現有的TRIZOL法、CTAB法等提取植物總RNA方法的基礎上進行改良，從富含有多糖的甜瓜干種子中提取高質量的總RNA。建立了18 S rRNA為內參基因的侵染葫蘆科作物4種主要種傳病毒的兩重RT-PCR檢測方法。應用改良TRIZOL法分別提取單粒和0.1 g（約20粒）帶毒甜瓜種子的總RNA作為檢測模板，分別對4種種傳病毒進行RT-PCR檢測，結果表明可分別從攜帶4種種傳病毒的甜瓜種子上檢測到對應的病毒，18 S rRNA基因能夠很好的作為內參基因對病毒檢測結果進行評估。

關鍵詞： 葫蘆科作物； 干種子； 多糖； 種傳病毒； 反轉錄聚合酶鏈式反應

Abstract： In order to establish a method of detection of the major seed-transmitted virus in dry cucurbit seeds，we modified the total RNA extract methods based on TRIZOL and CTAB，and then the high quality of total RNA was obtained from dry melon seeds rich in polysaccharide. A duplex RT-PCR method was developed for four kinds of seed-transmitted viruses infecting cucurbits respectively，including an internal amplification control 18 S rRNA gene of host. The total RNA extracted from single and mixture（about 20 seeds） infected melon seeds by modified TRIZOL method were used as templates of dulplex RT-PCR detection for the four kinds of viruses respectively. The results indicated that RT-PCR detection system was capable of detecting four different viruses pathogens in samples，and the 18 S rRNA gene as internal control was a useful indicator of the quality of plant total RNA extraction effect and the effectiveness of RT-PCR.

Key words： Cucurbitaceae； Dry seeds； Polysaccharide； Seed-transmitted virus； RT-PCR assay

葫蘆科（Cucurbitaceae）植物如黃瓜（Cucumis sativus L.）、西瓜（Citrullus lanatus）、甜瓜（Cucumis melo）、南瓜（Cucurbita moschata），是一年生或多年生攀緣性植物，作為重要的經濟作物在熱帶、亞熱帶以及溫帶地區世界范圍內大量種植。據FAO組織2013年統計數據，中國的黃瓜、西瓜和甜瓜占全世界種植面積和總產量均一半以上，居世界首位。隨著國際貿易的日益增長，種質資源引進的批次數量也逐漸增加，病毒隨種子傳入的可能性很高，一方面影響當年種質作物的品質和產量，并可能影響后代的產量和品質，另一方面還有可能引入新的危險性種傳植物病毒[1]。目前在葫蘆科作物上的已證實可通過種子傳播的病毒有11種，其中種子傳播造成嚴重危害的病毒有4種，分別是黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle virus，CGMMV）、甜瓜壞死斑點病毒（Melon necrotic spot virus，MNSV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和南瓜花葉病毒（Squash mosaic virus，SqMV）[2- 3]。

攜帶種傳病毒的種子可以成為病毒病害發生的早期侵染源。當存在有效昆蟲載體或機械接觸的情況下可使病毒在生長的植物中大面積傳播，阻斷種傳病毒的傳播可能具有非常重要的經濟意義[4]。防控種傳病毒傳播最有效辦法是阻止帶毒種子進入生產，所以亟需一套快速、簡便、靈敏的種傳病毒檢測方法。目前種傳病毒的檢測有生物學測定、免疫血清學法以及分子生物學方法。生物學測定需要制備接種物，在防蟲溫室中接種指示植物至少觀察2周以上，費時費力，且需要比較好的基礎設施。免疫血清學適合大量樣本的檢測，但是高靈敏、高特異性的抗體獲得不易，且易出現假陽性或假陰性[5]。種傳病毒的分子生物學檢測方法主要是RT-PCR，該方法靈敏度高，但是如何提取高質量的RNA是影響從種子上檢測種傳病毒效果的關鍵步驟。因為葫蘆科種子中含有大量多糖、蛋白質以及次生代謝物質，嚴重干擾了RNA的提取并抑制后續檢測中酶的活性[6]。

實驗室目前提取植物總RNA最常用的是Chomczynski[7]等提出的異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法，另外氯化鋰法、CTAB法、SDS法以及吸附柱法等在植物上使用也較多，但是以上方法單獨提取植物種子總RNA的得率或純度都不太理想[8-10]。胡群文等[8]利用SDS法和異硫氰酸胍法相結合從水稻、大豆、花生等作物的干種子中提取RNA；任增凱等[9]利用改良的CTAB法從花生種子、根莖等組織提取RNA；孫海波等[10]采用改良的吸附柱法從油菜、花生、芝麻和大豆等作物的種子提取總RNA，應用于RT-PCR或RT-qPCR均取得較好的結果。

本研究對目前實驗室常用提取植物總RNA的方法進行改良，希望建立一套適用于葫蘆科種子的快速、簡便的總RNA提取方法。并應用該方法提取的總RNA作為檢測模板，用于建立有內參控制的葫蘆科作物的主要種傳病毒的RT-PCR檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料

CGMMV、SqMV 、CMV、和MNSV 4種毒源由本實驗室分離、鑒定和保存。帶毒種子獲得：甜瓜種子（品種：‘落花甜）播種于溫室中，使其在夏季成熟。在2～3片真葉時單株摩擦接種病毒，CMV、SqMV與CGMMV接種于‘落花甜。2周以后，轉移入大花盆中，置于防蟲玻璃溫室中培養并進行人工授粉，并定期施肥和打藥。種子成熟后，獲得種子，置于4 ℃保存。MNSV來自江蘇海門經ELISA檢測陽性的感病甜瓜植株（‘海蜜1號）收獲的種子。

1.2 試劑與溶液配制

TRIzol Reagent購自Invitrogen；RNAiso plus購自TaKaRa生物公司。氯仿、異戊醇等其他試劑均為國產分析純試劑。高鹽溶液（0.8 mol·L-1檸檬酸鈉+1.2 mol·L-1氯化鈉），5 mol·L-1氯化鈉及5 mol·L-1醋酸鉀，均用0.1%（φ）DEPC處理后高壓滅菌；75%（φ，后同）乙醇（DEPC處理水配制）；CTAB提取液：2%（ω，后同）CTAB，2%（ω）NaCl，50 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 8.0），25 mmol·L-1 EDTA（pH 8.0），2%（φ）β-巰基乙醇；異硫氰酸胍溶液：4 mol·L-1異硫氰酸胍（GIT），25 mmol·L-1檸檬酸鈉（pH 7.0），0.5%（ω）十二烷基肌氨酸鈉（Sarcosyl），0.1 mol·L-1 β-巰基乙醇（用時再加每50 mL體系加0.36 mL）。研缽和玻璃器皿錫紙包裹，160 ℃烘烤4 h以上。不能用DEPC處理的溶液配制塑料制品。電泳槽、梳子用0.5 mol·L-1 NaOH浸泡30 min以上，自來水淋洗干凈。配制的溶液應盡可能用0.1%（φ）DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經直徑0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.3 總RNA提取與檢測

1.3.1 改良TRIZOL法 稱取大約0.1 g甜瓜種子置于用液氮預冷的研缽中，用研杵研磨成粉末狀。向研缽中加入1 mL TRIzol Reagent或者RNAiso Plus提取液，將粉末狀的樣品完全覆蓋，繼續研磨至裂解液呈透明狀。將裂解液轉移至1.5 mL離心管中，12 000 r·min-1 4 ℃離心5 min，取上清液加入 1/5 體積的 5 mol·L-1NaCl 和 3/5 體積的氯仿，用力振蕩，待溶液充分乳化后，再室溫靜置 5 min，12 000 r·min-1 4 ℃離心15 min，吸取上清液轉移至另一新的離心管中。如果要得到高純度RNA，可用水飽和酚、氯仿體積比為1∶1再抽提一次，最后向上清液中加入 1/2 體積的異丙醇和 1/2 體積的高鹽溶液，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫靜置10 min，12 000 r·min-1 4 ℃離心 10 min。一般在離心后，試管底部會出現沉淀。小心棄去上清液，加入 75%的乙醇 l mL洗滌離心管管壁，12 000 r·min-1 4 ℃離心2 min后，小心棄去乙醇（為了更好地控制 RNA 中的鹽離子含量，應盡量除凈乙醇）。室溫干燥沉淀 2～5 min，加入適量的 RNase-free水溶解沉淀，待 RNA 沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。單粒種子按上述比例加入適當TRIzol裂解液液進行總RNA提取。

1.3.2 CTAB-TRIZOL法 稱取大約0.1 g甜瓜干種子，在液氮預冷的研缽中，用研杵研磨成粉末狀。迅速轉移至含有0.6 mL CTAB提取緩沖液[（100 mmol·L-1 Tris，50 mmol·L-1 EDTA，pH 8.0，2 mol·L-1NaCl and 2% CTAB）；臨用前加入1%（φ）β-Mercaptoethanol]的離心管中，充分震蕩混勻后，室溫放置15 min。然后緩慢加入1/15體積無水乙醇和1/15體積5 mol·L-1 醋酸鉀（pH 4.8），輕輕混勻。加入0.6 mL氯仿、異戊醇體積比24∶1的溶液，充分震蕩混勻，在4 ℃ 13 000 r·min-1離心20 min。上清液轉移到一個新的離心管中，加入等體積的TRIzol，充分震蕩混勻后，室溫放置5 min，加入1/5 TRIzol體積的氯仿，充分震蕩混勻，13 000 r·min-1離心10 min。取上清液，如果要得到高質量的總RNA，上清液等體積的氯仿再抽一次，如果用于病毒檢測，則可以省略這一步。上清液中加入等體積的異丙醇，室溫放置10 min，4 ℃ 13 000 r·min-1離心10 min。一般在離心后，試管底部會出現沉淀。小心棄去上清液，加入 75%的乙醇 l mL洗滌離心管管壁，12 000 r·min-1 4 ℃離心 2 min后，小心棄去乙醇。室溫干燥沉淀 2～5 min，加入適量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA 沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。

1.3.3 CTAB-異硫氰酸胍法 前述步驟相同，第一次離心后上清液中加入等體積的異硫氰酸胍提取液；1/10體積2 mol·L-1 醋酸鉀；1 體積水飽和酚；1/5體積氯仿∶異戊醇（體積比為24∶1），溶液充分震蕩混勻，冰上放置15 min，13 000 r·min-1 4 ℃離心20 min，轉移上清至一新的離心管中，加入上清液等體積的氯仿再抽提一次，13 000 r·min-1 4 ℃離心5 min。上清液中加入等體積的異丙醇，室溫放置10 min，4 °C 13 000 r·min-1離心15 min。一般在離心后，試管底部會出現沉淀。為了得到最大量RNA，可以置于-20 ℃過夜沉淀。

1.3.4 總RNA質量檢測 NaOH浸泡過的電泳槽用流水沖洗干凈。30 mL的1.2%（ω）的瓊脂糖凝膠加入0.8 mL的37%（φ）甲醛然后加入EB制成甲醛變性瓊脂糖凝膠。變性凝膠先預電泳10 min后取4 μL RNA樣品與1 μL 6×loading buffer混勻，直接上樣，7.5 V·cm-1電壓下電泳。電泳結束后，凝膠成像系統觀察。

1.4 引物設計與RT-PCR反應體系

18 S rRNA和CMV引物根據趙麗等[11]和CGMMV引物根據黃靜等[12]報道合成；根據GenBank上登錄的MNSV和SqMV已知各病毒序列核苷酸序列，DNAMAN Version5.2.2比較了它們之間的保守序列區，并設計了特異性引物。以上引物均由北京三博遠志生物技術有限公司合成（表1）。

將反轉錄產物作為PCR 反應的模板，按次序在0.2 mL無菌離心管中加入以下成分：10×PCR buffer 2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1 each）2.0 μL，病毒和內參的特異正反向引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，RT產物2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，最后用ddH2O補足到20 μL。混勻后短暫離心，放入PCR儀的樣品孔上反應，退火溫度為54 ℃。在1.2%（ω）的瓊脂糖凝膠上（含0.5 μg·L -1 EB）電泳檢測。

1.5 種子帶毒檢測應用

本試驗采用改良TRIZOL法分別對單粒和0.1 g（約20粒）可能攜帶種傳病毒的甜瓜種子提取總RNA作為RT-PCT檢測模板，每種病毒單粒種子不少于10粒重復，0.1 g種子不少于5次重復。應用上述RT-PCR程序和反應體系進行檢測。

2 結果與分析

2.1 不同方法對甜瓜干種子RNA提取質量的影響

如圖1所示：改良TRIZOL法（采用TRIzol Reagent和RNAISO Plus 2種試劑）與CTAB-TRIZOL法和CTAB-異硫氰酸胍法均能提取甜瓜干種子組織總RNA，電泳條帶清晰，可見28 S rRNA，18 S rRNA，而且無拖尾現象，表明提取的RNA完整。整體上看，均無明顯的DNA和蛋白質污染。其中2種不同TRIzol試劑改良方法提取的總RNA質量也無明顯區別，1 h可完成。CTAB-TRIZOL法 和CTAB-異硫氰酸胍法存在DNA污染，但可經過DNase酶去除，所需時間需要1.5 h，比改良TRIZOL法耗時稍長。應用建立的方法提取甜瓜干種子總RNA，對提取的RNA通過RT-PCR擴增18 S rRNA，結果（圖2）表明：3種方法提取的總RNA經過RT-PCR擴增均可獲得單一的目的特異性條帶。

2.2 感染4種病毒的葉片的RT-PCR檢測

為驗證本試驗設計的4種病毒的檢測引物和RT-PCR反應體系效果，我們利用常規TRIZOL方法提取分別感染4種病毒的葉片和健康甜瓜葉片的RNA，分別對4種病毒及18 S rRNA進行RT-PCR檢測。檢測結果分別得到650、580、394、294、120 bp 5個片段（圖3），與引物設計的目的條帶完全符合。從整體上看4種病毒和植物內參18 S rRNA的擴增主條帶清晰明顯，且均無非特異性的條帶擴增。符合RT-PCR檢測病毒的要求。

2.3 分別攜帶4種病毒種子的RT-PCR檢測

對隨機選取的14?？赡軘y帶CGMMV的甜瓜進行檢測，其中7粒種子中檢測到CGMMV目的條帶，帶毒50%（圖4-A）；分別檢測可能攜帶CMV、SqMV和MNSV的種子10粒，均只有2粒檢測出對應的病毒的目的條帶（圖4-B、C、D），帶毒率20%。在可能攜帶CGMMV和SqMV的種子檢測中分別有1份樣本未檢測出作為內參的18 S rRNA條帶。對0.1 g（約20粒）種子大樣本4種病毒RT-PCR檢測。結果發現5份重復樣本中CGMMV、CMV、SqMV和MNSV分別被檢測出5、3、5和4份樣本呈現陽性（圖5）。

3 討 論

甜瓜干種子含有大量多糖、蛋白質以及次生代謝物質，其中糖類物質含量高達25%[13]，因此在抽提RNA過程中就必須首先要除去多糖的污染。多糖的許多理化性質與RNA很相似，在沉淀RNA 時，會產生多糖的凝膠狀沉淀與RNA共沉淀下來，造成RNA產量的減少；含有多糖的RNA沉淀難溶于水[14]。同時多糖可以抑制許多酶的活性，被多糖污染的RNA樣品無法用于進一步的分子生物學研究[6]。

Chomczynski等發明的酸酚/胍鹽RNA提取法是目前實驗室最常用的RNA提取方法，主要產品是TRIZOL。該方法的優點是采用單一試劑，并且操作簡單耗時較短，對大多數的動植物樣本都能得到質量很好的RNA樣品[7]。但是在乙醇或異丙醇沉淀步驟不能區別RNA和其他多糖，所以不適合于大部分富含多糖和多酚的植物材料。Fang等[6]在提取松樹等植物RNA時，提高Na+或K+濃度，用苯酚、氯仿抽提可以除去多糖。宋貴生等[15]在提取水稻未成熟種子RNA時，在用酸性酚抽提之前，加入1/10體積的5 mol·L-1 NaCl，混勻和離心后會看到白色沉淀，表明可以去除大部分多糖。同時在沉淀RNA時，加入等體積的高鹽溶液和異丙醇溶液，多糖物質更容易留在上清，而異丙醇選擇性將RNA沉淀下來[16]。本文中改良TRIZOL法就是在異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的基礎上，采用高濃度的NaCl來沉淀勻漿上清液中的多糖，同時在RNA沉淀時加入等體積的高鹽溶液和異丙醇溶液，在1 h之內即可得到高質量的總RNA，且不含有DNA污染，能滿足分子生物學檢測的需要。

CTAB是一種陽離子去污劑，在高離子溶液存在的條件下，CTAB 與多糖和蛋白質形成復合物而沉淀下來，而核酸仍然留在溶液中[17]。如Lewinsohn等[18]在應用CTAB法從裸子植物木質莖中提取RNA時，在勻漿上清液中加入乙醇至終體積分數10%；Bahloul等[19]在提取云杉組織的RNA時在勻漿上清液中加入1/3體積的5 mol·L-1醋酸鉀（pH 4.8）溶液以沉淀多糖。Su等[20]在去除褐藻的多糖時，應用乙醇和醋酸鉀兩者結合使用效果最佳。本試驗CTAB裂解步驟采用低溫下劇烈震蕩進行細胞裂解操作，使所有的細胞散開，在抽提緩沖液中蛋白質、多糖形成復合物并產生沉淀，無水乙醇和醋酸鉀同時沉淀多糖。再經過TRIzol或異硫氰酸胍提取步驟，可在90 min內完成整個抽提過程得到高質量RNA，雖有明顯DNA污染，但不會對RNA病毒檢測造成影響。比較本實驗中改良TRIZOL法和后兩種CTAB法中發現，前者操作和耗時更少，能獲得相當質量和數量的總RNA，能應用于隨后的病毒檢測。

對同一病毒而言，種傳率會隨寄主種類、品系、栽培環境與遭受病毒感染的時期而改變，大多數的種傳病毒其種傳率通常不高，但種傳率的高低并不與病毒對作物的影響程度成正比，與種子攜帶病毒的量成正比。所以檢測種子是否帶毒與帶毒率高低是衡量種傳病毒的潛在危險的方法[1]。本文在檢測4種病毒的單粒種子時，發現其不同病毒的帶毒率有一定的差異，CGMMV的帶毒達到50%，而其他3種病毒只有20%（圖4）。同時對20粒種子的大樣本檢測中發現有CMV的5份重復樣本只有3份能檢出病毒，則說明我們在一批次的種子檢測時應該多次抽樣檢測，才能確認該批次種子是否帶毒（圖5）。

在本文中，引入植物看家基因18 S rRNA衡量干種子總RNA質量和RT-PCR反應質量，能很好對整個檢測體系進行評估。在本試驗的單粒種子檢測中發現個別種子的18 S rRNA基因未擴增獲得目的片段，原因可能是在總RNA提取過程中誤操作導致RNA丟失。在病毒檢測試驗中引入18 S rRNA作為內參基因可避免假陰性的誤判。

4 結 論

本研究在現有TRIZOL法和CTAB法提取植物總RNA方法的基礎上進行改良，引入高鹽溶液大大提高去除多糖和多酚能力，應用該方法提取甜瓜干種子總RNA，可以滿足于種傳病毒RT-PCR檢測。同時建立了植物看家基因18 S rRNA為內參基因分別針對侵染葫蘆科作物的CGMMV、CMV、SqMV和MNSV等4種主要種傳病毒的兩重RT-PCR檢測方法。應用改良TRIZOL法和兩重RT-PCR法分別對攜帶4種病毒的單粒和0.1 g（約20粒）的甜瓜種子進行檢測，可檢測到對應的病毒，并且18 S rRNA作為內參基因可以對整個檢測體系進行評估，減少由于誤操作造成的假陰性誤判。

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