基于super—BSA技術開發甜瓜含糖量和酸度性狀的功能性分子標記

張紅　吳海波　李寐華　熊韜　王廣智　伊鴻平

摘 要： 為達到選育甜酸味品系、縮短育種周期、提高選擇準確率的目的，本研究基于簡化基因組測序（SLAF-seq）的選擇性基因型鑒定和集群分離分析（Super-BAS），結合生物信息學方法，以‘風味4號甜瓜F2群體甜味、酸味、不甜不酸3個極端表型群體為試驗材料，精細定位甜瓜含糖量、酸度性狀相關基因并開發功能性標記。結果顯示：（1）將甜瓜含糖量、酸度性狀定位在雙親基因組；（2）獲得1個含糖量性狀相關候選基因，3個酸度性狀相關候選基因；（3）針對候選基因開發出1個含糖量性狀相關基因功能性分子標記SLAF18745-S01和3個酸度性狀相關基因功能性分子標記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04。本研究開發的功能性分子標記為甜瓜品質性狀基因的分子標記輔助選擇提供了重要的標記基礎。

關鍵詞： 甜瓜； 含糖量； 酸度； 精細定位； 功能分子標記

Abstract： SLAF-seq-based selective genotyping and bulked segregant analysis（Super-BSA），together with bioinformatic methods were performed in three extreme phenotypes populations（sweetness，acidity and neither sweet nor sour） from the F2 population of a flavorful melon（Cucumis melo L.） ‘Fengwei No. 4； fine mapping of its genes related to sugar content and acidity traits was achieved and functional markers were developed. Results showed that：（i） both sugar content and acidity traits were mapped in parental genome；（ii） one sugar content trait-related candidate gene and three acidity trait-related genes were obtained；（iii） one sugar content（SLAF18745-S01） and three acidity （SLAF36334-S02，SLAF50072-S03 and SLAF31212-S04）trait-related gene functional molecular markers were developed based on the candidate genes. In conclusion，the functional molecular markers developed in this study provide an important marker foundation for molecular marker-assisted selection of quantitative trait loci of melons，which can reduce breeding cycles and improve the accuracy of selection.

Key words： Melon； Sugar content； Acidity； Fine mapping； Functional molecular markers

甜瓜（Cucumis melo L.）屬葫蘆科甜瓜屬，是一種重要的園藝作物，我國甜瓜的種植面積和產量均居世界第一。甜瓜是一種高多態性物種，含有各種不同果實風味的基因型[1-3]。

大多數果實的風味由糖、有機酸及果實特征香氣組成，糖含量是影響甜瓜果實品質的主要因子[4]，蔗糖是甜瓜果實成熟所積累的主要成分[5-7]。甜瓜栽培種果實有機酸含量很低，但甜瓜種（Cucumis melo）中存在高有機酸含量的遺傳變異[8-11]。近年來，育成了具有獨特酸甜味的甜瓜栽培種[12-14]。甜、酸等風味的變化是一個復雜的過程，受一系列相關基因的影響和調控[15]。定位甜瓜含糖量、酸度性狀相關基因并開發功能性標記，為提高甜瓜果實品質性狀選育效率及甜瓜分子育種提供思路。在現有甜瓜育種實踐中，對含糖量、酸度等風味性狀大多是通過表現型間接對基因型進行選擇，致使育種周期長，效率低，制約著甜瓜品種改良的進程[16]。分子標記輔助選擇，尤其是對與目標性狀關聯的功能性分子標記的選擇可極大提高選擇的效率，加速遺傳改良[17-18]。

現有技術中，功能性分子標記作為與表型相關的由功能基因序列中功能性單核苷酸多態性位點（SNP）開發而成的分子標記[19]，其開發必須具備以下2個條件：（1）有確定功能的候選基因并已知等位基因的序列信息；（2）在多個材料中對目標性狀進行調查，對目標基因進行序列分析，結合性狀和基因序列信息進行基于連鎖不平衡（LD）的關聯分析[20]。功能基因定位是功能性分子標記發掘的基礎，目前功能基因定位常用的方法有基于傳統遺傳圖譜定位與集群分離分析法（BSA）?；趥鹘y遺傳圖譜對甜瓜糖、酸性狀進行了QTL定位[8，21-23]，但該方法的周期長、密度低、成本高；而集群分離分析法（BSA）可快速、有效尋找與目標基因緊密連鎖的分子標記，但混池個數有限，一般不超過10個，關聯分析假陽性幾率大，標記密度低。近年來發展的選擇性基因型鑒定和集群分離分析（Super BSA），利用SLAF-seq（Specific Location Amplified Fragments sequence，特定位置擴增片段測序）[24]，選擇均勻分布在整個基因組、且避開重復序列區域的特異片段進行高深度測序，通過比較SNP標記的不同基因型在2個混池中出現頻率的差異，確定與性狀緊密相關的分子標記。Super BSA分子標記密度高，30～200個體的混池，保證了基因定位的功效和準確性。同時，由于SLAF標簽中的多態性位點已經定位在基因組上，可以根據基因組的位置使用引物設計軟件進行引物設計，開發功能標記。這些近幾年發展起來的分子標記技術，通過分子標記輔助選擇可以將傳統的表型選擇轉變為直接選擇基因型，具有重要的意義，但是至今未見開展甜瓜含糖量、酸度性狀相關基因功能性分子標記方面的研究和報道。

1 材料與方法

1.1 材料

高糖甜瓜自交系‘壽星為母本、高新果味自交系‘新果味為父本進行雜交，得到雜種F1即‘風味4號；由雜種F1自花授粉獲得F2代群體，對父母本、F1及每個F2代單株果實的含糖量、酸度利用PAL-1糖度測定儀（日本ATATO公司）、STARTER300便攜式pH計[奧豪斯儀器（上海）有限公司]測量并結合品嘗進行鑒定。

1.2 含糖量、酸度性狀相關基因定位

通過CTAB法[25]提取每份材料的基因組DNA，將5株父本、5株母本及甜味、酸味、不甜不酸各50個單株的基因組DNA等量混合，形成5個混池。利用酶切預測軟件SLAF_Predict（北京百邁客公司開發）分析甜瓜基因組，分別對5個混池基因組進行雙酶切，混池中各個樣品同一位點處的DNA片段序列經過PCR擴增、Illumina GA IIx（Illumina，San Diego，CA，USA）測序。Blat比對軟件對測序reads進行聚類、Cap snp 軟件檢測單核苷酸多態性，獲得多態性的SLAF標簽[26]。

選擇不甜不酸混池中a/b > 3或者b/B > 3的純和標記對含糖量、酸度性狀進行關聯定位。分別計算群體ac（不甜不酸）與ab（含糖量）之間和ac（不甜不酸）與aa（酸度）之間來源于不同基因型的差異比值，得到差異標記。將與含糖量、酸度性狀關聯的差異標記通過blat軟件比對，在雙親基因組上定位，注釋標記物理位置所在的基因，獲得與含糖量、酸度性狀相關的功能基因，挑選出處于功能基因外顯子的SLAF標簽。

1.3 功能性分子標記的開發及穩定性檢測

利用Primer Premier 5.0軟件，對功能基因外顯子的SLAF標簽設計引物，對甜味、酸味、不甜不酸及酸甜味材料基因組DNA，進行PCR擴增，PCR體系25 μL，含100 ng·μL-1模板DNA 1 μL、10×buffer 2.5 μL、2.5 mmol·L-1 dNTP 2 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各1 μL、5 U·μL-1 DNA Taq 酶0.3 μL、ddH2O 17.2 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，45～60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。用6% PAGE膠銀染檢測擴增產物。將只在母本、甜味及父本、酸味單株中有擴增產物，而在不甜不酸單株中沒有擴增產物的標記分別作為含糖量、酸度性狀功能性標記。

2 結果與分析

母本‘壽星味甜（TSS >12，pH>6），父本‘新果味味酸（TSS?8，pH ?5），F1‘風味4號酸甜味（TSS>12 ，pH?5），F2群體分離出4種類型，即甜味（TSS >12，pH>6）、酸味（TSS?8，pH ?5）、酸甜味（TSS >12，pH?5）和不甜不酸（TSS?8，pH>6）。采用Super-BSA技術，父本、母本及3個混池共獲得12 438 270 reads。深度大于10x以上的基因型的SLAF標簽 46 087個，整體平均深度達161.81x，多態性的SLAF 標簽4 480個，分別得到與含糖量性狀相關差異標記114個、酸度性狀相關差異標記215個。其中，連續3個以上滿足分離比例的標記所在的區域即為關聯區域，得到6個含糖量性狀相關候選區域，區域內共有13個差異標記，23個酸度性狀相關候選區域，區域內共有48個差異標記。13個甜味性狀差異標記中1個被定位在雙親基因組上、并處在功能基因的外顯子中；48個酸度性狀差異標記中3個定位在雙親基因組上并處在功能基因的外顯子中（表1）。

對1個含糖量性狀相關功能基因及3個酸度性狀相關功能基因的SLAF標簽的多態性序列，利用Primer Premier 5.0軟件各設計引物1對，引物序列見表2，以父本、母本、甜味、酸味、不甜不酸味單株為材料，進行PCR擴增，以發展含糖量、酸度性狀功能性標記。將只在母本、甜味及父本、酸味單株中有擴增產物，片段分別為249、66、283、274 bp，而在不甜不酸單株中沒有擴增產物的標記分別作為含糖量、酸度性狀功能性標記。結果成功發現了1個含糖量性狀相關功能性分子標記SLAF18745-S01（圖1），3個酸度性狀相關基因功能性分子標記SLAF36334-S02（圖2）、SLAF50072-S03（圖3）和SLAF31212-S04（圖4）。

進一步對F1、F2單株材料進行PCR擴增，驗證獲得的含糖量、酸度性狀相關基因功能性分子標記的穩定性。含糖量性狀相關基因功能性分子標記SLAF18745-S01在F1及F2中甜味、酸甜味材料中擴增出249 bp條帶，而F2中不酸不甜、酸味材料中沒有出現（圖5）。酸度性狀相關基因功能性分子標記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03、SLAF31212-S04只是在F1及F2中酸味、酸甜味材料中擴增出66、283、274 bp條帶，而F2中不甜不酸、甜味材料中沒有出現（圖6、圖7、圖8），說明4個功能性分子標記是穩定的。

3 討 論

前人基于傳統遺傳圖譜對甜瓜糖、酸性狀進行了QTL定位[8，21-23]，但并未進行分子標記的開發。Super BAS是利用生物信息學、高通量測序技術，通過30～200個體較大規模的混池，10 000+SNP高密度掃描，獲得覆蓋全基因組的海量序列信息，從而保證了基因定位的功效和準確性。目前利用高通量測序結合集群分離分析法（BSA）已成功精細定位水稻真菌稻瘟病[27]、小麥高籽粒蛋白含量基因GPC-B1[28]。本研究利用Super BSA技術，通過對具有不同甜味、酸味性狀親本及極端子代DNA混池的全基因組DNA標記高密度掃描，精細定位甜瓜含糖量、酸度性狀區域，開發出1個含糖量性狀相關基因功能性分子標記SLAF18745-S01和3個酸度性狀相關基因功能性分子標記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04。

通過應用甜瓜果實甜味、酸味性狀相關基因功能性分子標記，在不同世代間重復性好、操作簡便，為甜瓜品質性狀基因的分子標記輔助選擇提供了重要的標記基礎，可簡便、快速的應用于育種實踐，從而將傳統的表型選擇轉變為直接選擇基因型。對于甜瓜含糖量、酸度性狀的改良和改善具有重要的應用價值和意義，也為分子育種、系統進化、種質資源鑒定中分子標記的篩選提供了一種重要的開發途徑。

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