適配體在毒品毒物分析中的應用

孫美琪，曹芳琦，胡小龍，張玉榮，陸鑫蔚，李茂盛，曾立波

（1.中國醫藥工業研究總院 上海醫藥工業研究院 創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海200437；2.上海市公安局物證鑒定中心上海市現場物證重點實驗室，上海200083；3.上海市刑事科學技術研究院，上海200083）

鑒定綜述
R e v i e w

適配體在毒品毒物分析中的應用

孫美琪1，2，曹芳琦3，胡小龍2，張玉榮2，陸鑫蔚2，李茂盛2，曾立波2

（1.中國醫藥工業研究總院 上海醫藥工業研究院 創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海200437；2.上海市公安局物證鑒定中心上海市現場物證重點實驗室，上海200083；3.上海市刑事科學技術研究院，上海200083）

適配體是體外合成的能與蛋白質、其他小分子物質、有機離子等等各種配體特異結合單鏈DNA/RNA，是由SELEX（體外指數富集配體系統進化技術）技術篩選得到，適配體具有對靶標的高特異性和親和性、合適的化學穩定性、無免疫原性和毒副作用的優點。利用適配體的這些優越性是得適配體可以作為生物識別分子元件應用于傳感器及分析試紙中，進而可以快速高效的檢測毒物毒品。為了大大提高辦案的效率，為維護法治、打擊犯罪提供更好的技術支持，通過介紹了一種基于適配體（aptamer）為識別元件的高選擇、高靈敏、快速的毒物毒品檢驗方法。

適配體；SELEX；毒品毒物；檢測

1 適配體

早在20世紀60年代，人們就提出核酸除了具有模板功能，還能折疊成復雜的三維形狀，表現出生物化學活性。含有約1015個核酸分子的隨機序列寡核苷酸庫可以通過化學合成產生，且可以用于平行篩選以獲得具有特定功能的，如高親和性的結合配體（適配體）或催化活性的核酸酶（核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶）。Tuerk等[1]在1990年提出了一種新的體外篩選和擴增方法，命名為SELEX（指數級富集的配體系統進化）。他們應用一個組合核酸庫篩選RNA寡核苷酸，這些RNA寡核苷酸對非核酸靶標（T4DNA聚合酶gp43）結合非常牢固并具有選擇性。同年，Ellington等[2]也用相似的篩選方法從隨機序列的RNA庫中分離出RNA分子，這些RNA分子能識別并結合小分子有機染料（汽巴克隆藍、活性藍4）。他們將這些篩選出的個別的RNA序列命名為aptamer（“適配體”），它源于拉丁文詞aptus，意思為“適合”。兩年后他們又從一個化學合成的隨機序列的DNA庫中成功篩選到單鏈DNA（ssDNA）適配體[3]。

適配體的功能是以其穩定的三維結構為基礎，其三維結構取決于其一級序列、核苷酸分子的長度（少于100 nt）與環境條件。典型的結構單元包括莖，內環，凸環，發夾結構，四角環，假結體，三重體，吻合復合物和G-四鏈體結構。在靶分子存在時，適配體通過自適應的構象變化和三維折疊形成特異性的靶分子結合位點。適配體和靶分子間的作用結合了形狀互補，芳香化合物間的堆積作用，適配體的堿基堆積作用，帶電基團的靜電作用和氫鍵作用的特點[4-5]，這種對靶分子表現出高親和性結合和高特異性識別的適配體有時被形容為“化學抗體”，實際上它們表現出許多優于抗體的優點：（1）它們可以針對任何靶分子，包括毒性物質，而且適配體分子比抗體小（5～15kDa），可以接近免疫球蛋白很難接近的區域。（2）它們容易并且可重復合成，易于保存，具有化學穩定性。（3）它們易于化學修飾和簡單的設計，進而可方便與各種衍生物偶聯。因此，適配體成為開發分析方法的理想工具，在治療和診斷試劑、有效的生物傳感材料、有效的色譜、電泳[分離材料中扮演著重要的角色[6-11]。

在治療應用方面，1990年首次報道了評價適配體作為病理性靶蛋白抑制劑的研究。這個突破性的研究證明由HIV進化來的，一種利用病毒和細胞蛋白到病毒轉錄的TARRNA反過來能夠抑制該病毒的復制[12]。由tRNA啟動子表達的TAR適配體序列作為病毒Tat和CD4+T細胞中的細胞周期T1蛋白的誘餌寡核苷酸。表達高水平TAR適配體的細胞被證明它具有對病毒復制和細胞毒性的高度抗性[12-13]。這些結果描述了一種抑制HIV復制的新方法，第一次展示了RNA適配體能用作治療藥物，直接與臨床相關蛋白結合并抑制其活性。2004年是這個領域中具有里程碑的一年，美國食品與藥品監督管理局（FDA）批準哌加他尼那（Macugen）上市。第一個被批準的具有治療功能的適配體是人-VEGF（血管內皮生長因子）的適配體。這種適配體的聚乙二醇化的形式叫做哌加他尼，是新近開發的治療濕性老年性黃斑變性的藥物活性成分。抗血管上皮因子的適配體藥物（pegaptnib）已被美國食品和藥品管理局批準，用于治療新生血管老年性黃斑變性[14]。

除了治療市場，適配體也應用在新的分析系統和檢測方法的開發（例如，生物分析、醫學診斷，也包括環境分析）。比如將適配體引入分析器件，作為一種分子識別工具用在液相色譜、電色譜以及毛細管電泳等分離檢測方法中[15-18]，可以將兩者的優勢結合起來，是非常有效的分析手段。適配體的“靶分子廣、容易合成、具有核酸的性質”等特點，可以拓寬待測物范圍、降低成本、減少非特異性吸附。同時，適配體的高親和力保證了分離效果和選擇性。適配體也可結合納米等材料用于各種不同的生物分析檢測，這種功能化的適配體納米的使用即可在溶液相中進行也可在固相中進行，作為捕獲和信號放大工具的方法[19]，可在食品安全分析領域內對生物毒素、重金屬離子、農藥殘留等食品中的危害因子進行高靈敏、高特異性的快速檢測。

除此之外，治療和生物醫學用的適配體的發展正在一個廣泛的前沿領域推進[20-21]，而且適配體的醫學應用研究在腫瘤影像和治療[22-23]，流感病毒的檢測和抑制以及一般的臨床診斷方面更超前[24-26]。可以預計在不久的將來，大量的適配體將會發展成為藥物和分析診斷工具。

2 SELEX篩選技術原理

SELEX過程具有體外篩選和酶擴增的迭代循環特點，對于一個給定問題的解決，其模擬達爾文式進化的過程驅使篩選向相對少的，但最優化的結構靠近[27]。整個過程是連續的重復步驟，包括篩選（結合、分離、洗脫），擴增和調節（圖1）。整個過程開始于一個隨機的單鏈寡核苷酸庫，該庫通常含有約1015~ 1016個單鏈核酸，該核酸序列的5’和3’端都帶有一端固定的序列，在PCR過程中行使引物結合位點的功能，中間為隨機合成的序列。這種庫的中間隨機序列區一般包含有20~80 nt，兩端的引物位點分別為18~21 nt。對于DNA適配體的篩選，這個庫可以直接用于SELEX過程的第一輪篩選。對于RNA適配體的篩選，在開始SELEX篩選之前，必須將DNA庫轉錄為RNA庫。在第一輪SELEX篩選中，復雜的RNA或DNA庫與靶分子混合孵育，隨后通過嚴格的沖洗步驟，使形成的結合復合物與未結合的和弱結合的寡核苷酸分離。這是關鍵的步驟之一，對篩選的適配體的結合特性有極大影響。結合靶分子的寡核苷酸被洗脫，并通過PCR或RT-PCR擴增，通過純化相關的單鏈DNA或者通過體外轉錄和純化合成的RNA，使形成的雙鏈DNA轉化為一個新的寡核苷酸庫。這個新篩選出的富集的寡核苷酸庫在下一輪SELEX循環中再次用于與靶分子的結合反應，通過篩選和擴增的迭代循環，最初的隨機寡核苷酸庫減少為相對較少的、對靶分子具有最高親和性和特異性的基元序列。一般來說，適配體篩選需要6~20輪SELEX循環。

圖1 SELEX篩選過程圖

3 適配體在毒品毒物分析中的應用

自20世紀80年代世界毒品毒物犯罪活動日益猖獗起，有關于毒品檢測問題就迫切需要解決。而國內外陸續報道關于毒品毒物的多種檢測方法，多是需要依賴一些價格昂貴的檢測儀，這就限制了毒品毒物犯罪案件的現場快速檢驗。

張強等[28]將體外合成的ssDNA文庫固相化于瓊脂糖凝膠顆粒表面，液相中甲胺磷與其結合的DNA分子從固相表面分離，進而建立了非固相化SELEX技術。10輪篩選后，經熒光法檢測，篩選效率達到62.1%，并最終獲得了5條針對甲胺磷的核酸適體。

Handy等[29]首次篩選出一種小分子海洋生物毒素——蛤蚌毒素（STX）的核酸適體。STX經過化學修飾與血藍蛋白KLH偶聯形成STX-Jeffamine-KLH復合物，再將其固定在環氧基化磁珠表面，經過10輪篩選（其中4～10輪用Jeffamine-KLH反篩）獲得特異性識別STX的核酸適體。選取其中一條適體APTSTX1用SPR檢測，有良好的結合率且無交叉反應。

Anniron[30]在1997年報道了RNA適體檢測多巴胺的檢出限達到2.8 umol/L。

陸鑫蔚等[31]也利用SELEX技術成功篩選出可以特異性識別甲基苯丙胺的適配體，后期可以進一步做成作為生物分子識別元件應用于試劑盒或生物傳感器形式，攜帶方便，用于刑事案發現場，便于快速檢測。

Baker等[32]建立了電化學傳感器平臺來檢測可卡因。將亞甲基藍連接到適配體的一端，適配體通過另一端固定在電極表面，且適配體作為檢測適配體-結合反應的氧化還原探針。靶分子不存在時，認為適配體部分保持展開結構，在氧化還原探針與電極表面間有較大的距離。靶分子存在時，適配體可能折疊成結合位點，探針和電極表面的距離減小，改變了電子傳遞，增加了可測的亞甲基藍的還原峰。

Li[33]成功的分離了可卡因和其類似物愛康寧。他們將靶分子本身作為信號探針，發展了一系列基于適配體-CE技術的分析方法。可卡因及其類似物愛康寧在分子結構中都含叔胺基團，因此都能夠作為三聯吡啶釕的共反應物，在鉑電極上產生電化學發光現象。所以兩種物質的混合樣品經過CE分離，會產生兩個ECL峰，如果樣品中含有一定量的可卡因適配體，可卡因與適配體復合物的形成，使游離的可卡因的數目減少，復合物和游離的可卡因在毛細管中會被分離，可卡因自身的峰降低。與此同時，愛康寧不與適配體作用，它的峰不會變，所以通過可卡因的峰降低可直接實現對可卡因的選擇性識別和定量檢測，檢測限為2umol/L。

liu[34]基于帶有測流技術的試紙樣平臺對可卡因進行檢測，使用先前報道的腺苷和可卡因的適配體開發了這種新的適配體試紙[35]，可卡因檢測也應用在人血清樣品中。這種分析形式大多是用于抗體的受體，但是抗體穩定性差、不能在常溫貯藏下長期保持生物活性問題，而適配體在高溫或不良環境下非常穩定、經濟性強，可用來替代抗體[1，36]。這種試紙經過后期改進做成快速檢測試劑盒，可以達到對可卡因的犯罪現場快速檢測。適配體對靶標的高特異性和親和性使得以適配體為識別分子的高選擇、高靈敏、快速的毒物毒品檢驗方法必能為維護法制、打擊犯罪提供更好的技術支持。

此外，本課題也初步篩選出能夠識別氯胺酮的適配體，并對該適配體的特異性、親和性進行表征，證明了該適配體不會與美沙酮、美沙芬發生交叉反應，進一步可以將該適配體作為識別分子研制成試劑盒，可以達到現場快速檢測的目的，同時，也避免了交叉反應提高了準確性。

4 展望

核酸適配體作為一種人工合成的核酸，具有穩定的二級結構和高特異性、高親和力、便于化學修飾與功能化等特點，且易于進行大量低成本的可重復性合成。無機離子、有機分子、生物大分子蛋白質、酶、受體等乃至細胞、微生物均可能存在與其相對應的高特異性親和配體。核酸適配體的篩選過程，不依賴于生物體，并且適配體的篩選過程無需在生理條件下進行，可以篩選出沒有免疫原性或低免疫原性，甚至具有毒性的靶物質的核酸適配體。除此之外，這些核酸適配體的末端易于修飾上各種活性基團如：氨基，磷酸基，巰基，熒光標記物，電化學標記物等，用于表面固定修飾或者檢測。基于這些優點，適配體在醫療診斷、治療手段、新藥物的開發、藥物輸送系統、生物影像、分析試劑、毒品毒物檢測、食品安全分析等領域扮演著重要的角色。然而，核酸適體技術在毒品毒物分析領域的應用才剛剛起步，有很多可深入開發和研究的內容，總結起來主要有以下兩個方面。

首先，針對特異性識別小分子毒品毒物的核酸適配體的篩選。SELEX過程起始于一個隨機的含有約1 015~1 016個單鏈寡核苷酸庫，該庫中間為隨機序列，兩端為引物結合為點。這個庫是否是真正的隨機是整個適配體篩選過程的第一個關鍵步驟。序列隨機性發生一點偏離，就可能導致序列空間的歪曲，反過來就限制了能夠和靶分子高特異性結合的適配體的捕獲。因此，寡核苷酸庫的質量尤其重要。適配體篩選過程中寡核苷酸分離的常用方法是通過過濾或磁珠捕集或親和柱捕集，必須先將靶分子固定于分離膜、磁珠或親和柱上，而很多毒品毒物為小分子物質，需要對其構建活性基團才能固定于分離基質上。然而，這種對小分子的改性是否會掩蓋活性位點，是否會造成非特異性吸附等問題仍需要更深的研究。

其次，適配體作為生物識別分子引入毒品毒物快速檢測方法的開發中。眾所周知，在案發現場快速準確檢測毒品毒物，能大大提高辦案的效率。適配體對于靶分子具有高度的特異性和親和性，以及超越抗體的優越性使得適配體可以作為生物識別分子元件應用于傳感器及分析試紙。但是，核酸適配體分子的優化條件、靈敏度的提高方法仍需探討。隨著研究的深入，適配體作為一種新的識別元素會產生高選擇、高靈敏、快速的毒物毒品檢驗方法，從而為維護法制、打擊犯罪提供更好的技術支持，在毒品毒物檢測中展現魅力。

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（本文編輯：卓先義）

App lication of Aptam ers in Forensic Toxicology

SUNMei-qi1,2,CAO Fang-qi3,HU Xiao-long2,ZHANG Yu-rong2,LU Xin-wei2,LIMao-sheng2,ZENG Li-bo2
(1.State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Technology,Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai200437,China;2.Shanghai Key Laboratory of Criminal Scene Evidence,Institute of Forensic Science, Shanghai Public Security Bureau,Shanghai200083,China;3.Institute of Criminal Science and Technology, Shanghai Public Security Bureau,Shanghai200083,China)

Aptamers are synthetic single stranded RNA or DNA molecules capable of specifically binding to other target molecules.Aptamers are commonly performed by the SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) process.They are of high specificity and affinity to targets,chemical stable,non-immunogenic and have no side effects.With these advantages,aptamers can be applied in sensors and strips as recognition entities to achieve the rapid detection of drugs and toxicants.A highly sensitive,specific and rapid method based on aptamers for the detection of drugs and toxicants is introduced in this paper.

aptamer;SELEX;drug and toxicant;detection

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2015.02.014

1671-2072-（2015）02-0075-05

2014-07-16

上海市科委項目（12231202800）

孫美琪（1987—），女，碩士研究生，主要從事毒物分析與分子免疫學研究，Email：mqsun1216@163.com。

曾立波（1954—），男，研究員，主任法醫師，一級法醫官，碩士研究生導師，主要從事分子免疫學研究和法醫毒物、毒品分析研究。E-mail：merry.magin@163.com。