基因修飾的臍血MSCs移植對帕金森病大鼠旋轉行為研究

樊志剛　王東

[摘 要] 背景：目前臨床治療帕金森病以藥物為主，細胞移植治療逐漸成為一種趨勢，基因修飾過的臍血干細胞能否改善癥狀鮮見報道。目的：觀察TH修飾的HUMSCs移植對帕金森病大鼠旋轉行為的影響。方法：將酶切鑒定后的新構建質粒pEGFP-C2-TH經電穿孔法轉染培養第4代HUMSCs，注射到PD大鼠模型右側腦室，觀察大鼠行為學變化，移植細胞在大鼠腦組織內的遷移。結果與結論：質粒pEGFP-C2-TH轉染HUMSCs移植后8周，細胞逐漸向腦室轉移，PD大鼠癥狀顯著改善（P<0.05），移植細胞可以在PD大鼠腦內存活。TH修飾的大鼠HUMSCs經腦室移植對PD大鼠具有明顯治療作用，為臨床中干細胞移植的應用提供實驗依據。

[關鍵詞] 基因治療；臍血來源間充質干細胞；帕金森病；大鼠；酪氨酸羥化酶

中圖分類號：R394 文獻標識碼： A 文章編號：2095-5200（2015）03-030-05

帕金森病（Parkinsondisease，PD）的病因尚未明確，與遺傳在內的多種因素有關[1] 。其病理特征為黑質致密部的色素脫失和多巴胺神經元的大量死亡[2]。好發于中老年人，平均始發年齡為57歲，60歲以上患病率達1%～2%。目前，據統計，世界上約有500萬名帕金森病患者[3]，其中170萬在中國[4] 。隨著人口老齡化，患病率和發病率呈明顯的增長趨勢[5]。雖然近年來藥物治療[6]方面的研究使帕金森病癥狀得到有效控制，但仍有許多問題亟待解決，比如：藥物不良反應、藥效降低、癡呆、平衡障礙等，如何進行個性化治療[7] 給現有藥物治療提出了巨大挑戰。帕金森病的外科治療主要包括蒼白球損毀術、腦深部電刺激等，應用受限于手術的適應證、手術技術的高要求、并發癥的高風險[8]、昂貴的醫療價格等。

目前，細胞治療成為新方向，主要是將各種多巴胺能細胞移植入紋狀體，多年來人們嘗試各種細胞作為種子細胞進行研究。干細胞移植和基因治療為帕金森病[9-11]臨床治療開拓了廣闊前景，PD也是公認的適合進行細胞移植和基因治療的病種之一[12-15]。細胞治療比藥物治療更接近于患者生理模式。干細胞因其具有向多巴胺能神經元分化的潛能而成為細胞治療中極為常用的種子細胞，主要包括胚胎干細胞[16]、成人神經干細胞、骨髓間充質干細胞等。但是它們面臨道德倫理、來源受限、免疫排斥等棘手問題，臨床研究發展受到極大限制。

臍血是胎兒出生時臍帶內和胎盤近胎兒一側血管內的血液。臍血中含有豐富的造血干細胞和間充質干細胞（mesenchymal stem cells.MSCs）[17]，是近幾年來發現的一類具有與骨髓干細胞相同的多向分化潛能的原始祖細胞，并且來源豐富，免疫排斥低。酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是兒茶酚胺類神經遞質即多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素生物合成過程所需的限速酶，也是DA能神經元的標志酶，它以四氫生物喋呤啶（BH4）為輔酶，催化酪氨酸的羥化而生成多巴（DOPA）。

本實驗將大鼠酪氨酸羥化酶（tyrosinehydroxy-lase，TH）基因修飾的人臍血來源間充質干細（Humanumbilical cord blood -derived mesenchymal stem cell，HUMSCs）立體定向注射到PD大鼠腦室內，觀察經TH修飾后的HUMSCs在大鼠腦內的存活、遷移情況，以及移植后對帕金森大鼠旋轉行為影響，為進一步實驗和臨床移植途徑選擇提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

2012年3月至10月在鄭州大學醫學院干細胞研究中心完成隨機對照動物實驗。健康雄性SD大鼠30只，體質量200～400g，購自河南省實驗動物中心。實驗過程中對動物的處理符合科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。主要試劑：6-羥基多巴胺、阿樸嗎啡購自Sigma公司；小鼠抗酪氨酸羥化酶購自Gibco公司；DMEM購自天津TBD公司；淋巴細胞分離液（1. 077 g/cm3）購自北京中杉公司；NucleofectorTM 細胞核轉染儀購自德國Amaxa公司。

1.2 方法

pEGFP-C2-TH構建：將pGEM—TH-3在引物1：5ˊ-TACTTGAGCGCCCACCCC-3ˊ，引物2：5ˊ-GTGTCTACTTAATGGCACTCA-3ˊ擴增后的TH基因與pEGFP-C2連接，引入XhoⅠ和SaⅡ雙酶，行酶切電泳檢測。

PD模型的建立：用35g/L水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉SD大鼠后，將大鼠固定于立體定向器上，以前囟為零點，參照包新民等[18]的《大鼠腦立體定位圖譜》，確定大鼠右側MFB和VTA兩點坐標（MFB為前囟后4.0mm，矢狀縫右側1.8mm，顱骨下7.9mm；VTA為前囟后4.6mm，矢狀縫右側1.4mm，顱骨下7.9mm）。向每點用微量進樣器注射新鮮配置的6-OHDA溶液6 μL（3g/L，溶于含質量分數為2 g/L抗壞血酸的生理鹽水中），注射速度為0.5μL/min，留置空針10 min，以1mm/min的速度緩慢退針。1周后腹腔注射阿樸嗎啡（1.0mg/kg）以誘發旋轉實驗，隨機將26只造模成功大鼠分成實驗組與對照組，每組13只。

pEGFP-C2-TH轉染 HUMSCs：臍血來源于鄭州市婦幼保健醫院產科，參照文獻[19]分離并純化HUMSCs，取第三代MSCs，在NucleofectorTM儀 A=31程序下進行轉染.然后繼續培養3d，進行TH免疫組化，計算轉染率和融合蛋白表達率。

HUMSCs的移植：將調整細胞濃度調整為2.0×105μL-1，立即進行細胞移植。將帕金森病模型大鼠麻醉后固定于立體定位器上，以前囟為零點，定位右側紋狀體2個移植點：前囟前1.2 mm，矢狀縫右2.8mm，顱骨下5.2 mm；前囟前1.2 mm，矢狀縫右2.8mm，顱骨下7.2mm。實驗組每點注射6μLHUMSCs，注射速度0.5μL/min，注射完畢后留針10min，以1mm/min的速度緩慢退針。對照組按上述方法和坐標，注入6μL的PBS。

1.3 觀察指標及統計分析

①移植后每周1次腹腔注射阿樸嗎啡（1.0 mg/kg）觀察帕金森病大鼠旋轉行為的改善。②移植后8周、12周取腦制作冰凍切片。用熒光顯微鏡觀察HUMSCs細胞的存活與遷移情況。

統計學分析：數據以均數±標準誤表示。采用SPSS11.0版軟件包對帕金森病大鼠移植前后旋轉次數行重復測量數據的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 實驗動物數量

30只實驗大鼠，造模成功的26只全部進入結果分析。

2.2 HUMSCs的分離和純化

HUMSCs接種后第1天，細胞基本呈圓形，懸浮狀；3天后貼壁，原代細胞呈細長型，圓錐狀，散在分布，數目稀少，消化后繼續傳代培養，1周后，細胞生長達90%融合，多數HUMSCs細胞呈長梭型，貼壁牢固，排列緊密，取第三代細胞備用。（圖1-圖3）

2.3 質粒pEGFP-C2-TH的酶切鑒定

電泳結果中，質粒pEGFP-C2-TH在雙酶切后表達的目的片段及質粒pGEMTH-3經PCR擴增后的DNA片段與質粒pGEMTH-3酶切下釋放的TH基因（1.77kb）大小一致。（圖4）

1：XhoⅠ和SaⅡ雙酶切后4.8kb和1.8kb產物 2：BamHⅠ單酶切Pgemth-3后1.7kb和2.7kb片段 3：以Pgemth-3為模板的PCR產物1.7kb目的片段 4：DNA Marker

圖4 質粒pEGFP-C2-TH的酶切電泳圖

2.4 質粒pEGFP-C2-TH轉染 HUMSCs后的表達

轉染細胞培養4h后，開始貼壁，細胞生長達70%左右瓶底覆蓋率時，計算轉染率為（56.2±6.8）%，TH細胞免疫組化計算表達率為（88.6±5.9）%（圖5-圖6）

2.5 移植后PD大鼠旋轉行為的改變

（1）30大鼠中，共有26只成為PD大鼠模型，成功率為87%，主要表現為行動遲緩，少動，豎毛，躬身，尾僵以及頭偏斜、嗅探等。注射6-OHDA后1周5只成功（占16.7%），第3周18只成功（占60%），成功PD大鼠逐漸增多，而4～8周成功PD穩定在26只。

（2）實驗組PD在移植后2周，活躍度較對照組增高，活動范圍開始增大，自主覓食行為增強，實驗組和對照組 PD大鼠APO誘發后均出現恒定旋轉，旋轉次數分別為（15.7±1.9 ）r/min和（15.6±3.3） r/min，差異無統計學意義（P>0.05）。移植后4周，旋轉次數均出現減少，分別為（12.6±1.8 ）r/min和（10.5±2.3） r/min，功能行為得到好轉，但差異無統計學意義（P>0.05）。移植后8周和12周，旋轉次數繼續減少，分別為（11.4±1.9 ）r/min、（6.8±1.9） r/min和（10.8±1.5 ）r/min、（4.6±0.8） r/min，均表現為實驗組平均旋轉圈數較對照組顯著減少，差異有統計學意義（P < 0.05）。見下表1。

2.6 TH修飾的HUMSCs在大鼠腦內遷移情況

移植4周后實驗組處死動物做組織切片觀察，發現HUMSCs在注射點附近散在分部（圖7），8周時，可見植入的細胞逐漸向外遷移，分布于腦室前1.7mm、腦室后3.3mm，以及腦室膜下（2.7±0.2）mm范圍內，呈帶狀分布（圖8）。12周時見向皮質遷移（圖9），免疫組化顯示移植的細胞TH表達陽性（圖10）。實驗組健側和對照組均未發現間充質干細胞。

3 討論

PD是一種與年齡相關的神經變性疾病，主要是黑質紋狀體區的多巴胺能神經元的減少或消失。目前，干細胞生物學的研究與應用日益受到關注，干細胞具有自我更新和多向分化潛能[20]，骨髓間充質干細胞研（Bone mesenchymal stem cells.BMSCs）研究較多[21-23]，有實驗表明，BMSCs在體外純化后，移植入PD大鼠腦內，可在腦內分化為多巴胺能神經元，明顯增加多巴胺含量[24]，可改善癥狀，但臍血來源間充質干細胞較少報道，臍血作為一種新的可靠干細胞來源，有自身很多優點，尤其是HUMSCs在適當條件下具有向神經細胞、成骨細胞、肝細胞等組織細胞的多項分化潛能[25-27]，并且HUMSCs容易獲取、能有效表達外源基因。體外研究中，HUMSCs可在多種因子的共同誘導下表達TH[28]，而TH陽性的表達正是多巴胺能神經元的基本特征，在體內定向分化的報道不是很多。和其他來源干細胞相比，臍血來源廣泛，臍血中淋巴細胞的免疫功能不夠成熟，免疫原性較弱，移植物抗宿主病發生率較低；臍血中間充質干細胞易于分離[29]。本研究以HUMSCs為種子細胞，為進一步的實驗及臨床應用奠定基礎。

質粒pEGFP-C2-TH修飾后的HUMSCs表達TH及增強型綠色熒光蛋（EGFP），TH是DA合成的限速酶，在PD患者腦內TH蛋白質含量與細胞內THmRNA含量是同步降低的，有實驗表明未修飾的臍血間充質干細胞植入紋狀體內可顯著提高中腦內DA的含量[30]，但并不穩定，且提高的含量有限。因此，本實驗采用TH基因修飾的干細胞植入紋狀體內，使其表達TH基因，使HUMSCs具有DA能神經細胞的部分特征；另一方面，共表達EGFP作為指示劑，是TH基因表達及移植細胞遷移的客觀觀察指標，本研究中TH和EGFP的共表達率為88.6%，使HUMSCs在PD大鼠移植后的追蹤及TH的表達更為直接和可視化。

本研究移植TH修飾的HUMSCs后，熒光顯微鏡下觀察顯示4周時，外源性細胞主要分布注射點附近，8周時，開始向周圍遷移，12周時遷移至皮質周圍。PD組模型大鼠旋轉行為在4周時，與對照組相比，下降了約16%，統計顯示P>0.05，8周時，下降了45%，12周時，下降了60%，統計顯示均P<0.05，與免疫組化結果相一致。熒光顯微鏡下觀察提示了HUMSCs在大鼠冠切面上可以在室管膜下沿腦室呈帶狀分布。由此初步認為HUMSCs可以穿過血腦屏障而在腦組織內存活，與此前研究中發現骨髓源及胎源干細胞可以通過血腦屏障相類似[9]，但是其通過血腦屏障機制尚不清楚。現對于單純的臍血腦內移植治療PD[31]，經基因TH修飾的細胞活動范圍更大，存活時間更長。

TH基因修飾的HUMSCs可以通過腦室移植途徑對PD大鼠起到一定的治療作用，為基礎研究和臨床治療提供了依據，HUMSCs雖然在腦內可以表達TH抗原，但是否能分泌多巴胺，除了表達TH外，是否能分化為其他相關神經遞質類細胞，如：腎上腺能，膽堿能神經元等，都有待進一步研究。

參 考 文 獻

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