HPLC法比較不同產地白花蛇舌草中兩種香豆素類成分的含量

于亮　呂青濤　黃祝剛　左琳　滿其倩　容蓉　鞏麗麗　蔣海強

[摘 要] 目的：比較不同產地白花蛇舌草中兩種香豆素類成分東莨菪亭和耳草酮B的含量，為完善白花蛇舌草藥材質量標準提供參考依據。方法：采用Agilent Eclipse SB-C18色譜柱（5 ?m，4.6 × 250 mm），以甲醇-0.05%甲酸水為流動相，梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測波長367 nm，柱溫30 ℃。結果：東莨菪亭和耳草酮B分別在0.34 μg·mL-1 ～ 5.40 μg·mL-1和0.32 μg·mL-1 ～5.12 μg·mL-1范圍內線性關系良好，溶液穩定性、重復性及加樣回收率良好；江西產藥材中兩種香豆素類成分的含量明顯高于湖北、安徽、廣西其它三個產地的藥材，而產自廣西的藥材含量最低且沒有檢出耳草酮B。結論：本方法簡便，準確度高，可用于不同產地白花蛇舌草藥材中東莨菪亭和耳草酮B含量的比較測定。

[關鍵詞] 白花蛇舌草；東莨菪亭；耳草酮B；高效液相色譜法；含量測定

中圖分類號：O657 文獻標識碼： A 文章編號：2095-5200（2015）03-085-03

白花蛇舌草（Hedyotis diffusa）為茜草科耳草屬植物，具有清熱、解毒、消腫、止痛之功效[1]，現主要用于抗癌治療與研究[2]，含有黃酮類，三萜類，蒽醌類，環烯醚萜苷類，甾醇類，香豆素類，烷烴類等化學成分。其中含有的香豆素類成分東莨菪亭具有解熱[3]、抑制PC3細胞增殖與誘導凋亡的作用[4]，其亦可通過影響胞內鈣代謝產生血管舒張作用[5]。另一呋喃香豆素類成分耳草酮B對Hep G2細胞有較為明顯的抑制作用[6]。

課題組在對白花蛇舌草氯仿部位進行抗子宮內膜癌活性研究時，通過活性篩選分離得到了東莨菪亭（scopoletin）和另一活性成分，此成分的1H-NMR，13C-NMR數據與文獻[6]中數據一致，確定為耳草酮B（hedyotiscone B），為首次于白花蛇舌草中分離得到。

白花蛇舌草中東莨菪亭與耳草酮B的含量測定尚未見文獻報道。為考察藥材中兩種成分的含量及其與抗癌作用的關系，本文建立了HPLC法測定白花蛇舌草中東莨菪亭和耳草酮B含量的方法，并對四產地白花蛇舌草藥材中兩種成分的含量進行了測定及對比，也為白花蛇舌草藥材質量方法研究提供參考依據。

1 儀器與試藥

Agilent高效液相色譜儀，Eclipse SB-C18色譜柱（5 ?m，4.6 × 250 mm）（安捷倫科技有限公司），AE240型電子天平（瑞士梅特勒公司），KQ5200DB數字超聲清洗器（昆山超聲儀器公司），甲醇為色譜純（禹王化工公司），水為蒸餾水，其他試劑為分析純。

對照品東莨菪亭（標準品批號：D-020-140728）由北京寶賽希望生物科技提供，對照品耳草酮B由本實驗分離純化，經HPLC檢測，東莨菪亭和耳草酮B純度均> 98%。白花蛇舌草藥材購自漱玉平民藥店、七星藥店和康之源藥店，經山東中醫院大學藥學院李峰教授鑒定為茜草科耳草屬白花蛇舌草（H. diffusa Willd.）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent Eclipse SB-C18色譜柱（5 ?m，4.6 × 250 mm）；流動相為甲醇–0.05%的甲酸水溶液梯度洗脫（0～15 min：甲醇比例30%～45%；15～16 min：甲醇比例45%～55%；16～30 min：甲醇比例55%）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長為367 nm；進樣量為20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取東莨菪亭13.5 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，得東莨菪亭對照品母液（1.35mg·mL-1），取母液適量稀釋成濃度為3.38×10-4

mg·mL-1，6.75×10-4 mg·mL-1，1.35×10-3 mg·mL-1，2.70×10-3 mg·mL-1，5.40×10-3 mg·mL-1的東莨菪亭對照品溶液，用于線性關系考察；精密稱取耳草酮B 12.8 mg，同樣步驟配得耳草酮B對照品母液（1.28mg·mL-1），進而稀釋成濃度為3.20×10-4 mg·mL-1，6.40×10-4 mg·mL-1，1.28×10-3 mg·mL-1，2.56×10-3 mg·mL-1，5.12×10-3 mg·mL-1的耳草酮B對照品溶液用于線性關系考察。分別取兩種母液適量混合并稀釋得兩種成分的混合對照品溶液，用于色譜峰定位。

2.3 供試品溶液的制備

不同產地白花蛇舌草分別經干燥粉碎后，精密稱取約1.0 g，用40%乙醇于90℃回流提取兩次（第一次加溶劑80 mL、提取1.5 h，第二次加溶劑50 mL、提取50 min），合并提取液經減壓回收溶劑至干，所得干燥物用氯仿超聲提取3次[7]，每次30 mL，提取5 min，合并提取液經減壓至干后用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系的考察 取2.2項下的東莨菪亭和耳草酮B對照品溶液，按2.1項下的色譜條件進樣，測繪東莨菪亭和耳草酮B的峰面積，以峰面積平均值為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X）進行線性關系考察，東莨菪亭對照品溶液的線性方程和相關系數為y = 45848x +2.3895，R2 = 0.9990，即在3.38×10-4

mg·mL-1～ 5.40×10-3 mg·mL-1范圍內線性關系良好；耳草酮B對照品溶液的線性方程和相關系數為y = 43882x - 1.8533，R2 = 0.9992，即在3.20×10-4 mg·mL-1～5.12×10-3 mg·mL-1范圍內線性關系良好。取2.2項下的混合對照品溶液在相同色譜條件下進樣，結果見圖 1中A。

A 混合對照品

B 江西產批號為130301的供試品

圖1 高效液相色譜圖

1-東莨菪亭；2-耳草酮B

2.4.2 精密度試驗 取2.3項下江西產批號為130301的供試品溶液，按2.1項下色譜條件，連續測定 6次，測得東莨菪亭和耳草酮B的峰面積，計算RSD分別為1.63%，1.41%。

2.4.3 穩定性試驗 取2.3項下同一份供試品溶液，按2.1項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h測定，結果表明供試品溶液在24 h內穩定。供試品溶液中東莨菪亭峰面積的RSD為1.8%，供試品溶液中耳草酮B峰面積的RSD為1.5%。

2.4.4 重復性試驗 取同批號江西白花蛇舌草藥材（批號130301）約1g，按2.3項下制備6份，按2.1項下色譜條件，測定東莨菪亭含量為0.0010%，RSD=2.0%；耳草酮B含量為0.0017%，RSD=1.7%，表明該方法重復性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取同批號江西白花蛇舌草藥材（批號130301）已知含量的供試品3份，每份約1 g，每份按10 mL、20 mL、30 mL 三個體積加入2.70×10-3 mg·mL-1的東莨菪亭對照品溶液和2.56×10-3 mg·mL-1的耳草酮B對照品溶液，按2.3項下方法制備成供試品溶液，測定含量，計算回收率，結果見表1。

2.5 含量測定

取2.3項下各產地供試品溶液，在2.1色譜條件下分別進樣，測得東莨菪亭和耳草酮B含量，平行操作3次，結果見表2。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

同一批藥材提取時，曾用95%乙醇、70%乙醇、40%乙醇、純水分別回流提取，發現70%乙醇、40%乙醇對兩種香豆素類成分提取率最佳，但70%乙醇對耳草酮B提取率相對較少，故選擇40%乙醇對藥材提取測定。回流提取后再用氯仿超聲提取，經HPLC檢測，此法制備東莨菪亭和耳草酮B，兩種香豆素類成分提取完全，且干擾少。

3.2 洗脫條件的選擇

由于兩目標組分極性相差較大，若使用等度洗脫，分析時間較長，且兩目標色譜峰與雜質峰亦達不到很好分離，故流動相使用等度洗脫。梯度洗脫易造成重現性不佳，解決辦法是延長進樣前平衡時間，且每次采用相同的平衡時間，平衡時間為15min。

3.3 檢測波長的選擇

供試品中東莨菪亭與香豆酸出峰時間基本相同，香豆酸對東莨菪亭的檢測造成干擾，通過比較光譜圖發現香豆酸在367 nm 波長下無吸收，而東莨菪亭與耳草酮B在367nm均有較好吸收，故采用此波長作為檢測波長，從而可消除香豆酸的干擾，實現對東莨菪亭和耳草酮B的同時測定。

3.4 實驗結果的分析

四產地中產自江西的白花蛇舌草中東莨菪亭和耳草酮B含量均是最高，再次是湖北、安徽、廣西，而產自廣西的沒有耳草酮B檢出。提示在對白花蛇舌草提取分離分析兩種目標成分時，宜選用江西產地的白花蛇舌草。

參 考 文 獻

[1] 黃建榮，劉詠海，喻志標，等.白花蛇舌草化學成分和藥理活性研究進展[J].中成藥， 2005，27（11）：1329-1331.

[2] 王順啟，陳力，倪虹，等.白花蛇舌草對肝癌細胞SMMC-7721基因表達的影響[J].中藥材， 2007，30（10）：1285-1289.

[3] 楊柯，曾春暉.莨菪亭解熱作用機理實驗研究[J].中國藥物應用與檢測，2006，3：24-27.

[4] 劉雪莉，張亮，付新錄.莨菪亭對PC3細胞增殖和凋亡的影響[J].中國藥理學報，2001， 22（10）：929-933.

[5] OLIVEIRA E J，ROMERO M A，SILVA M S，et al.Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin.[J].Planta Med，2001，67（7）：605-8.

[6] Chen YH，Chang FR，Wu CC，etc. New cytotoxic 6-oxygenated 8，9-dihydrofurocoumarins， hedyotiscone A-C， from Hedyotis biflora[J]. Planta Med. 2006， 72（1）： 75-78.

[7] 高曉霞，宋擎，吳維明，等.高效液相色譜法測定打碗花根中莨菪亭含量[J].中國醫院藥學雜志，2008，28（5）：366-368.