甲氨蝶呤聯合復方風濕寧對類風濕性關節炎滑膜成纖維細胞Treg/Th17免疫平衡的影響

李曉佳，趙迎杰，孫廣臣

(1.桂林醫學院 免疫學教研室，廣西 桂林 541000；2.山西醫科大學第二臨床醫院 骨科，山西 太原 030001；3.桂林醫學院 藥學院，廣西 桂林 541000)

?

甲氨蝶呤聯合復方風濕寧對類風濕性關節炎滑膜成纖維細胞Treg/Th17免疫平衡的影響

李曉佳1，趙迎杰2，孫廣臣3Δ

(1.桂林醫學院 免疫學教研室，廣西 桂林 541000；2.山西醫科大學第二臨床醫院 骨科，山西 太原 030001；3.桂林醫學院 藥學院，廣西 桂林 541000)

目的 研究復方風濕寧(compound Fengshining，FSN)聯合甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)對類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)滑膜成纖維細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)Treg/Th17免疫平衡的影響。方法 體外培養RA FLS，分別用FSN和MTX處理，分為FSN 1、2、3組(0.01、0.1、1.0 mg/mL FSN)，MTX 1、2、3組(0.01、0.1、1.0 mg/mL MTX)，聯合1、2、3組(0.01 mg/mL FSN+0.01 mg/mL MTX、0.1 mg/mL FSN+0.1 mg/mL MTX、1.0 mg/mL FSN+1.0 mg/mL MTX)，并以未加藥的培養基作為對照組，共10組。采用MTT法檢測各組RA FLS增殖情況，Real-time PCR法檢測各組IL-10、IL-17、Foxp3、ROR-γt mRNA表達，ELISA檢測各組IL-10、IL-17、IL-22水平。結果 FSN各組、MTX各組和聯合各組FLS增殖OD值均低于對照組，尤以聯合2組降低最顯著(P<0.05)。FSN2組、MTX2組和聯合2組IL-10 mRNA、Foxp3 mRNA表達均高于對照組，ROR-γt mRNA表達低于對照組，尤以聯合2組變化顯著(P<0.05)。FSN2組和聯合2組IL-17mRNA表達均低于對照組，以聯合2組降低顯著(P<0.05)。FSN2組、MTX2組和聯合2組IL-10水平均高于對照組、IL-22水平均低于對照組，以聯合2組變化明顯(P<0.05)。聯合2組IL-17水平低于對照組(P<0.05)。結論 FSN聯合MTX能夠抑制RA FLS增殖，升高IL-10、Foxp3表達，降低IL-17、ROR-γt表達，調節Treg/Th17免疫平衡，以0.1 mg/mLFSN+0.1 mg/mL MTX的效應最為明顯。

甲氨蝶呤；復方風濕寧；類風濕性關節炎；調節性T細胞

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性進行性自身免疫性疾病，以關節滑膜炎及對稱性關節骨、軟骨破壞為主要特征。多數患者發病時成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)存在病理性增生。RA病因尚不清楚，但多項研究表明它的發生與免疫異常有關，CD4+T細胞免疫功能紊亂是其發病的關鍵環節[1]。調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)和輔助性T淋巴細胞17(T helper cell 17，Th17)是近年來發現的新型T細胞亞群，在分化、發育以及功能發揮的過程中受到Th1型、Th2型效應細胞以及自身分泌的細胞因子調節，參與自身免疫病、感染、腫瘤等疾病的發生和發展[2]。已有研究證實[3]，在RA中存在一個重要平衡，即Treg/Th17 平衡，平衡一旦被破壞，將引發疾病，維持Treg/Th17的平衡對于RA 的治療非常重要。通過對Treg和Th17分化發育和功能發揮過程中關鍵因子進行增強或抑制，可以調節Treg/Th17的平衡關系，用于RA預防和治療。

復方風濕寧和甲氨蝶呤均為臨床上治療RA常用藥物。其中FSN有效成分從七葉蓮、寬筋藤、兩面針等中藥提取，具有祛風、除濕、止痛的作用，同時還能發揮活血、散瘀、解毒功能[4]；MTX是一種葉酸還原酶抑制劑，能夠抑制二氫葉酸還原為有生理活性的四氫葉酸，進而抑制DNA的生物合成，可有效抑制自身免疫反應過度激活[5]。FSN和MTX均為臨床上治療RA的核心藥物，但其抗RA的機制是否與調節Treg/Th17免疫平衡有關目前尚未明確。為此，本課題將探討FSN聯合MTX對RA FLS Treg/Th17免疫平衡的影響及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 人關節滑膜組織取自桂林醫學院附屬醫院收治并行膝關節置換術的RA患者，采集后保存于無菌含雙抗Hank’s液中，并于30 min之內轉移至實驗室進行細胞培養。RA患者符合中華醫學會風濕病學分會《類風濕關節炎診治指南》[6]診斷標準，告知患者研究事項，且患者均簽署知情同意書。收住院后完善術前檢查，進行關節鏡下滑膜切除術。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑：低溫高速離心機(TGL20M，麥尚儀器)；酶標分析儀(318C，上海精科)；梯度 PCR 擴增儀(600，Takara)。

甲氨蝶呤注射劑(齊魯制藥，國藥準字H20045628)、復方風濕寧注射劑(廣東羅浮山國藥，國藥準字Z20027146)，溶于無菌生理鹽水，調整初濃度均為10 mg/mL，臨用前稀釋成所需要的濃度。DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶及I型膠原蛋白酶(GIBCO)；β-actin、IL-10、IL-17、Foxp3、ROR-γt引物(上海玉博生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑鹽(上海生工)；RNA提取試劑盒(美國Promega公司)；逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)；IL-10、IL-17、IL-22 ELISA試劑盒(CUSABIO公司)。

1.2.2 RA FLS細胞培養：滑膜組織在無菌條件下PBS液沖洗3次，剪取滑膜時剔除連帶血管、脂肪及軟組織，取出滑膜后用PBS液沖洗3次。將滑膜剪到最小為止，1000 r/min離心5 min，棄上清，用4 mg/mL的I型膠原蛋白酶消化120 min(37 ℃、5% CO2恒溫孵育)后1000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS重懸，再次1000 r/min離心10 min，棄上清，最終懸浮于含青-鏈霉素(100 U/mL)及10%FBS DMEM培養液，37 ℃、5% CO2恒溫孵育。72 h后更換培養液，第一次換液時采取半量換液法，此后隔天換液，顯微鏡下觀察細胞生長情況。當原代細胞長滿瓶底時，以胰酶消化進行傳代培養。并留取3～4代穩定細胞用于本次實驗。

1.2.3 細胞分組及干預：取對數生長期的RA FLS，用胰酶消化，調整細胞濃度為5×104個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，繼續培養24 h后吸棄培養基，按照不同藥物處理方法設置10個分組：FSN 1、2、3組(0.01、0.1、1.0 mg/mLFSN)，MTX 1、2、3組(0.01、0.1、1.0 mg/mL MTX)，聯合1、2、3組(0.01 mg/mL FSN+0.01 mg/mL MTX、0.1 mg/mL FSN+0.1 mg/mL MTX、1.0 mg/mLFSN+1.0 mg/mL MTX)，并以未加藥培養基作為對照組。

1.2.4 FLS增殖檢測方法：采用MTT法測定細胞增殖能力，方法如下：給藥后繼續培養48 h，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，在孵箱中繼續培養4 h，待培養基顏色變為深藍色后吸除液體，加入150 μL DMSO溶液，在搖床上快速震蕩10 min使細胞充分裂解，而后在酶標儀上測定570 nm處的吸光度(OD)值。計算細胞增殖抑制率：IR(%)=(1-A給藥/A對照)×100%，6個復孔均值作為一組結果。

1.2.5 mRNA含量檢測方法：采用RT-PCR方法檢測，取對數生長期的RA FLS，調整細胞濃度為3×104個/mL，接種于24孔板，每孔500 μL，繼續培養24 h后吸棄培養基加入含藥培養基進行藥物干預，據1.2.3結果選取聯合2組，FSN2組，MTX2組及不加藥培養基作為對照組，共4組。加藥后繼續培養24 h，后收集細胞于1.5 mL離心管中，5000 r/min 4 ℃離心5 min吸出上清液(ELISA備用)，加入Trizol，嚴格按照試劑盒說明書提取RNA，并采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳測定其分子質量。反轉錄合成cDNA(嚴格按照試劑盒說明書操作)，檢測mRNA含量時，采用RT-PCR試劑盒分別擴增β-actin、IL-10、IL-17、Foxp3、ROR-γt，PCR循環擴增條件為：95 ℃ 5 min，(95 ℃ 30 s；β-actin、IL-10、IL-17、Foxp3、ROR-γt分別58 ℃、55 ℃、55 ℃、57 ℃、56 ℃1 min；72 ℃ 1 min)34個循環，72 ℃延伸10 min,4 ℃ 30 min。

所用引物序列如下：

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primers sequences

取PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外線下識別電泳條帶，用凝膠成像分析軟件分析，以特異性產物擴增條帶灰度值與內參條帶灰度值之比為半定量數據，分析4組基因表達水平，計算目的基因mRNA的相對含量，3個均值作為一組結果。

1.2.6 IL-10、IL-17、IL-22水平：以3000 r/min離心20 min取上清液(取1.2.5中提取RNA前吸出的上清液)，用ELISA法對IL-10、IL-17、IL-22水平進行檢測,嚴格按照說明書操作，測定吸光度，根據標準曲線計算IL-10、IL-17、IL-22濃度，8個復孔均值作為一組結果。

2 結果

2.1 MTT檢測OD值及抑制率比較 MTT檢測結果顯示，與對照組相比，FNS各組、MTX各組和聯合各組FLS增殖OD值均降低(P<0.05)，但以聯合2組增殖OD值降低最明顯(P<0.05)，抑制率最高。見表2。

表2 各組纖維樣滑膜細胞增殖OD值與抑制率比較(n=6)Tab.2 Comparison of OD values of FLS proliferation and inhibition rate(n=6)

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與聯合2組比較，compared with combination group 2

2.2 IL-10、IL-17、Foxp3，ROR-γt的mRNA含量 各組RT-PCR凝膠電泳圖見圖1。與對照組比較，聯合2組、MTX 2組、FSN 2組IL-10、Foxp3 mRNA含量明顯升高(P<0.05)；聯合2組、FSN 2組IL-17、ROR-γt mRNA含量明顯降低(P<0.05)；MTX 2組ROR-γt mRNA 含量明顯降低(P<0.05)。與聯合2組比較，MTX 2組、FSN 2組IL-10、Foxp3 mRNA含量明顯降低(P<0.05)；IL-17、ROR-γt mRNA含量明顯升高(P<0.05)。見表3。

圖1 各組RT-PCR凝膠電泳圖1-2：對照組，3-4：聯合2組，5-6：MTX2組，7-8：FSN2組Fig.1 RT-PCR gel electrophoresis figure of each group1-2：control group，3-4：combination group 2，5-6：MTX group 2，7-8：FSN group 2

組別IL-10IL-17Foxp3ROR-γt對照組0.12±0.030.89±0.020.13±0.011.09±0.04聯合2組0.48±0.06*0.35±0.01*0.44±0.03*0.36±0.02*MTX2組0.29±0.05*#0.92±0.090.28±0.02*#0.90±0.04*#FSN2組0.28±0.02*#0.65±0.03*#0.27±0.05*#0.69±0.07*#

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與聯合2組比較，compared with combination group 2

2.3 IL-10、IL-17、IL-22水平 與對照組相比，聯合2組、MTX 2組、FSN 2組IL-10水平增高(P<0.05)；與聯合2組相比，MTX 2組、FSN 2組IL-10水平降低(P<0.05)。與對照組相比，聯合2組IL-17水平降低(P<0.05)。與對照組相比，聯合2組、MTX 2組、FSN 2組IL-22水平降低(P<0.05)；與聯合2組相比，MTX 2組、FSN 2組IL-22水平增高(P<0.05)。見表4。

組別IL-10IL-17 IL-22對照組35.50±3.93149.91±26.62188.13±13.67聯合2組77.25±7.21*107.72±21.86*109.53±12.69*MTX2組62.52±4.90*#129.85±19.98147.98±5.86*#FSN2組65.12±8.10*#128.60±20.96154.51±9.70*#

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與聯合2組比較，compared with combination group 2

3 討論

FLS過度增生和局部炎性反應是RA的兩大臨床病理特征，研究表明[7]，RA發病過程中，FLS可由正常水平的1～3層細胞增至15 層以上；且增生的FLS具有類似腫瘤細胞的高侵襲性，凋亡反應受到抑制，持續分泌大量基質金屬蛋白酶，破壞軟骨組織。因此治療RA最重要的是要保護滑膜。本次實驗以RA FLS為研究對象，探討FSN聯合MTX是否可抑制骨破壞及其可能機制。并采用MTT法分析了滑膜細胞的增殖情況，結果顯示：FSN和MTX治療后均能抑制FLS的增殖(P<0.05)，但以2者聯合使用時抑制率最為明顯，且以0.1 mg/mL FSN+0.1 mg/mL MTX抑制率最高。

輔助性T細胞亞群Th1和Th2是最先被認識的T細胞亞群，Th1/Th2比例失衡是導致自身免疫性疾病發生的關鍵環節[8]。Th1細胞所分泌的細胞因子具有促炎、加強免疫反應的作用，而Th2型細胞因子則能抑制Th1細胞的功能。RA患者多存在Th2細胞功能減弱、無法有效抑制自身免疫反應的情況[9]。Treg 和Th17細胞是新近發現的CD4+T細胞亞型，已有文獻報道[13]表明，Treg和Th17細胞在RA的致病過程中發揮著極為重要的作用，調節Th17/Treg平衡已逐漸成為治療RA的新途徑，進一步推進了對RA 發病機制的研究階段，成為治療RA研究的又一熱點。

Treg是一群包含了CD4+T細胞、CD8+T細胞以及自然殺傷細胞的一群具有免疫調節功能的T細胞亞群，其中以CD4+CD25+Treg最為重要[10]。CD4+CD25+Treg能夠抑制抗原遞呈細胞的功能、降低致炎因子分泌、維持免疫內環境穩定的功能[11]。Foxp3是Treg細胞表面最可靠的標志物，在絕大多數CD4+CD25+Treg細胞中均有表達[12]，Foxp3發揮轉錄因子的作用，能夠促進免疫抑制因子IL-10等的分泌，具有負性免疫調節以及維持自身免疫耐受的功能。Th17細胞是一群能夠分泌白細胞介素-17的CD4+T細胞亞群，不僅可以大量分泌IL-17，還能產生IL-21、IL-22，具有極強的促炎作用，能夠促進滑膜細胞分泌多種細胞因子、抑制軟骨基質合成、增強破骨細胞的功能，最終造成骨質破壞[13]。在RA患者體內，ROR-γt的轉錄因子功能增強、IL-17含量增多，且Foxp3的轉錄因子功能減弱[14]。然而，目前有關FSN聯合MTX治療RA與Treg/Th17之間的關系還未見報道，為此本實驗采用FSN和MTX聯合干預RA FLS后，Real-time PCR法檢測各組細胞IL-10及其轉錄因子Foxp3、IL-17及其轉錄因子ROR-γt的mRNA表達，并用ELISA法檢測各組IL-10、IL-17水平。結果顯示，MTX與FSN聯合用藥可以顯著增加IL-10、Foxp3表達并降低IL-17、ROR-γt的表達，達到調節Treg/Th17平衡的目的。

Th17細胞分泌產生的另一種炎癥因子IL-22，在炎癥免疫性疾病的發病機制中介導了重要環節。IL-22能促進RA成纖維樣滑膜細胞增殖及趨化因子的分泌，是RA發病中一種重要的炎性因子[15]。新近研究顯示，RA患者的滑膜液中存在大量的IL-22，IL-22缺陷的CIA模型鼠，關節炎的發病率和炎癥嚴重程度降低[16]，且IL-22能促進RA滑膜細胞增殖，提示IL-22在RA中的致病性[17]。IL-22高表達還可促進纖維細胞膜表面RANKL增加，加速破骨細胞生成。故IL-22可作為RA早期骨侵蝕的血清學標志，預測發病程度。本研究在前期實驗中對IL-22做過重點考察，發現MTX和FSN均能降低RAFLS IL-22 mRNA表達水平，且聯合應用時效果最佳。本次實驗采用ELISA法檢測各組IL-22水平發現，2者聯合用藥顯著降低IL-22水平，這與前期實驗結果一致。

本實驗提示，FSN聯合MTX能夠抑制滑膜成纖維細胞增殖，并可能通過增高IL-10、Foxp3提高Treg，降低IL-17、ROR-γt及IL-22的表達降低Th17，調節Treg/Th17免疫平衡，從而抑制破骨細胞形成，防止骨質破壞，控制RA病情，但是本實驗由于樣本量較小并且尚未進行動物實驗對照，其作用機制有待進一步研究。

[1] 孔長旺，陳廖斌，汪暉，等.阿魏酸鈉對大鼠抗原誘導性關節炎的影響[J].武漢大學學報(醫學版)，2011，32(1)：40-43.

[2] Kleijwegt FS, Laban S, Duinkerken G, et al.Critical role for TNF in the induction of human antigen-specific regulatory T cells by tolerogenic dendritic cells[J].J Immunol,2010,185(3):1412-1418.

[3] 楊金娜，劉曉光，李覃，等.Th17/Treg平衡在類風濕關節炎中作用的研究進展[J].中國藥理學通報，2013,29(8)：1045-1048.

[4] 韓玉剛，王猛.風濕寧配合西藥治療類風濕性關節炎的臨床應用[J].中國現代藥物應用，2013，7(8)：95.

[5] 莊銘城，陳榮慶.小劑量潑尼松聯合甲氨蝶呤或來氟米特治療類風濕關節炎的臨床療效[J].現代醫院，2014，14(4)：46-48.

[6] 中華醫學會風濕病學分會.類風濕關節炎診治指南(草案)[J].中華風濕病學雜志，2003，7(4)：250-254.

[7] 姚瑤，葛衛紅.來氟米特活性代謝物terifunomide聯合甲氨蝶呤對類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞的影響[J].醫藥導報，2013,32(7)：839.

[8] Carranza F, Falcon CR, Nunez N, et al.Helminth antigens enable CpG-activated dendritic cell to inhibit the symptoms of collagen-induced arthritis through Foxp3+ regulatory T cells[J].PLoS One,2012,7(7):e40356.

[9] 仝巖，任偉宏，趙航，等.類風濕關節炎患者外周血CD4+T細胞亞群的分析[J].細胞與分子免疫學雜志，2013，29(8)：854-857.

[10] 李燕，胡俊平，巫婷婷.青蒿聯合甲氨蝶呤對類風濕性關節炎患者血TNF-α、IL-10水平的影響[J].河南中醫，2012，32(4)：433-435.

[11] Kleijwegt FS, Laban S, Duinkerken G, et al.Critical role for TNF in the induction of human antigen-specific regulatory T cells by tolerogenic dendritic cells[J].J Immunol,2010,185(3):1412-1418.

[12] 蔡智慧,梁義娟,馬幼菊，等.女性不孕患者血清、宮頸黏液中免疫性抗體及內膜組織中CD4+CD25+FoxP3調節性T淋巴細胞含量的檢測[J].海南醫學院學報，2015,141(2)：231-233，237.

[13] 封桂英，郭明，宋鴻儒，等.以Th17/Treg為靶點治療類風濕性關節炎的研究概述[J].時珍國醫國藥，2013，24(4)：911-913.

[14] Matsuki F,Saegusa J,Miyamoto Y,et al.CD45RA-Foxp3(high) activated/effector regulatory T cells in the CCR7+ CD45RA-CD27+CD28+central memory subset are decreased in peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,438(4):778-783.

[15] Zenewicz LA,Flavell RA.Recent advances in IL-22 biology[J].Int Immunol,2011,23(3):159-163.

[16] Pan HF,Li XP,Zheng SG,et al.Emerging role of interleukin-22 in Autoimmune diseases[J].Cytokine Growth Factor Rev,2013,24(1):51-57.

[17] Roeleveld DM,Marijnissen RJ,vanden Berg WB,et al.A1.22 IL-22 Drives the initiation and augmentation of TH17-dependent experimental arthritis[J].Ann Rheum Dis,2014,73(Suppl 1):A9.

(編校：王儼儼)

Effect of compound Fengshining combined with methotrexate on Treg/Th17 immune balance in fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis

LI Xiao-jia1, ZHAO Ying-jie2, SUN Guang-chen3Δ

(1.Department of Immunology, Guilin Medical University, Guilin 541000, China; 2.Department of Orthopaedics, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 3.College of Pharmacy, Guilin Medical University, Guilin 541000, China)

ObjectiveTo study the effect of compound Fengshining (FSN) combined with methotrexate (MTX) on Treg/Th17 immune balance in fibroblast-like synoviocytes (FLS) with rheumatoid arthritis (RA).MethodsRA FLS were cultured in vitro and treated with FSN and MTX.They were divided into ten groups: FSN 1, 2, 3 groups (0.01, 0.1, 1.0 mg/mL FSN), MTX 1,2,3 groups (0.01, 0.1, 1.0 mg/mL MTX), combination 1,2,3 groups (0.01 mg/mL FSN+0.01 mg/mL MTX, 0.1 mg/mL FSN+0.1 mg/mL MTX, 1.0 mg/mL FSN+1.0 mg/mL MTX) and the medium without drugs as control group.FLS proliferation was detected by MTT method. IL-10,IL-17, Foxp3, ROR-γt mRNA were detected by real-time PCR method. IL-10, IL-17，IL-22 levels were detected by ELISA method.ResultsOD values of FLS proliferation in FSN groups, MTX groups and combination groups were significantly lower than those in control group, especially combination 2 group changed significantly (P<0.05).IL-10 mRNA, Foxp3 mRNA in FSN 2 group, MTX 2 group and combination 2 group were higher and ROR-γt mRNA were lower than those in control group, especially combination 2 group changed significantly (P<0.05).IL-17 mRNA in FSN 2 group and combination 2 group were lower than those in control group, especially the combination 2 group changed significantly (P<0.05).IL-10 level in FSN 2 group, MTX 2 group and combination 2 group were higher and IL-22 levels were lower than those in control group, especially combination 2 group changed significantly (P<0.05).IL-17 level in combination 2 group were lower than those in control group (P<0.05).ConclusionCompound Fengshining combined with methotrexate could inhibit RA FLS proliferation, elevate IL-10 and Foxp3 expression, reduce the IL-17 and ROR-γt expression and adjust Treg/Th17 immune balance; effect of 0.1 mg/mL FSN +0.1 mg/mL MTX is the most obvious.

methotrexate; compound Fengshining; rheumatoid arthritis; regulatory T cells

國家自然科學基金(81260462，81460474)

李曉佳，女，碩士，研究方向：免疫藥理，E-mail：417517652@qq.com；孫廣臣，通訊作者，男，博士，研究員，研究方向：免疫藥理，E-mail：sungc2004@aliyun.com。

R593.2

A

1005-1678(2015)06-0006-04