黃芪多糖抑制糖原合成酶激酶3β活性與核轉位及其調控糖穩態的作用研究

徐俊，張思敏Δ，薛軍，張萬里，郭建榮

(1.武漢市兒童醫院 重癥醫學科，湖北 武漢 430016；2.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院 腫瘤中心，湖北 武漢 430023)

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黃芪多糖抑制糖原合成酶激酶3β活性與核轉位及其調控糖穩態的作用研究

徐俊1，張思敏1Δ，薛軍2，張萬里2，郭建榮2

(1.武漢市兒童醫院 重癥醫學科，湖北 武漢 430016；2.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院 腫瘤中心，湖北 武漢 430023)

目的 觀察黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)對糖穩態的調節作用，研究糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)活性及其亞細胞定位(核轉位)情況。方法 體外培養HepG2人肝癌細胞，用不同濃度高糖(30、40 mM)誘導肝細胞內質網應激模型，選擇最佳工作糖濃度，用不同濃度的APS(50、100、200、400 μg/mL)處理肝細胞以選擇最大有效濃度。按照不同處理方法將細胞分為：陰性對照組(C)、陽性對照組(Tm)、30 mM高糖誘導組(G30)、45 mM高糖誘導組(G45)、陰性對照+APS處理組 (CA)、陽性對照+APS處理組(TA)與高糖應激+APS處理組(GA)，共7組。采用MTT法檢測不同濃度APS對HepG2細胞增殖的影響，實時定量PCR反應檢測HepG2細胞內XBPl mRNA的剪切水平與轉錄水平，免疫印跡技術檢測組胞漿和胞核內GSK3β磷酸化水平。結果 選擇30 mM高糖作為工作糖濃度，APS最大有效濃度200 μg/mL，對細胞進行干預處理。GA組細胞內質網應激細胞XBP1的轉錄和剪切水平均顯著低于G30組(P<0.05)，但TA組與Tm組XBP1的轉錄和剪切水平差異無統計學意義。與G30組比較，GA組胞漿和胞核內GSK3β磷酸化水平均顯著增加(P<0.05)，但TA組與Tm組組胞漿和胞核內GSK3β無顯著性變化。結論 APS能顯著改善肝臟脂肪變性，其機理與APS減少肝臟GSK3β的活性特別是核定位并減輕肝臟內質網應激有關。

黃芪多糖；糖原合成酶激酶3β；內質網應激；HepG2細胞；糖穩態

黃芪是目前臨床常用的中藥材，新近的研究表明黃芪中的提取物黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)具有降糖及抗癌等作用[1]，但目前APS對肝癌的抑制作用尚無相關研究且具體作用機制研究也較少[2-4]。本研究對體外HepG2人肝癌細胞給予不同處理方式，研究APS 對于糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)活性和亞細胞定位的影響，并進一步探討了GSK3 的活性和核轉位增強與高糖誘導的內質網應激共同存在的可能性，及不同濃度APS對高糖的調控及其作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 黃芪(北京同仁堂飲片責任有限公司，產品批號皖Y20050032)自制黃芪多糖，制備方法參照趙魯杭的提取方法[5]中水煎提取工藝的改良法與SephadexG-150柱層相配合提取，多糖含量測定參考文獻[6]的方法，細胞培養前使用0.22 μm無菌濾器過濾。

HepG2人肝癌細胞購自中國科學院典型培養物細胞庫，葡萄糖、DMSO、衣霉素(tunicamycin)(美國Sigma)，普通高糖、低糖和液體無糖DMEM培養基、胎牛血清(美國Invitrogen-GIBCO)，PCR引物(上海生工生物工程技術服務公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 HepG2人肝癌細胞培養：取HepG2人肝癌細胞接種于24孔板內DMEM完全培養基)，培養基為含3%標準胎牛血清(FBS)的DMEM培養基，每孔1 mL，培養條件為37 ℃、5%CO2培養箱。待細胞長滿后繼續培養48 h，進行后續試驗。

1.2.2 建立高糖誘導的肝細胞內質網應激模型：將對數期生長期的細胞接種到含3%標準胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中：30 mM高濃度葡萄糖[G30，30 mM高糖+]及45 mM高濃度葡萄糖[G45，45 mM 高糖+含3% FBS的DMEM培養基)]，同時設置陰性對照組[C，25 mM標準高糖+含3% FBS的 DMEM 培養基]，各組置37 ℃、5%CO2條件下分別培養5 h及陽性對照組衣霉素[Tm，10 μg/mL tunicamycin+含3% FBS的 DMEM培養基]置37 ℃、5%CO2條件下4 h處理細胞16 h，每組設置6個復孔。通過檢測內質網中X 盒結合蛋白l(X-box binding protein 1,XBP1)表達量評價高糖誘導內質網應激模型。

1.2.3 APS對內質網應激的肝細胞模型的影響：選取30 mM高糖誘導肝細胞內質網應激模型作為研究對象，分別加入不同濃度的APS(50、100、200與400 μg/mL)，將細胞按5000～10000個/孔接種到96孔板中,每組設置6個復孔，置于37 ℃ 5%CO2條件下常規培養24 h后,棄上清。MTT法檢測APS對細胞增殖的影響：加入5 mg/mL MTT(用pH7.4PBS配制)20 μL/孔,再置37 ℃ 5%C02條件下4 h,棄去上清液,加入DMSO 200 μL/孔,混勻30 min后,在酶聯檢測儀(美國Bio Tek公司，型號ELx808)上570 nm波長處測吸光度值,計算各處理因素對肝細胞生長的影響,尋找對細胞不造成損傷的情況下APS的最佳濃度。

1.2.4 肝細胞核酸的提取及實時定量PCR反應：采用Trizol法提取肝細胞RNA，引物設計，按照一步法RT-PCR反應試劑盒要求稍作改動進行操作。RT-PCR反應體系為50 μL。具體組成如下：AWV/Tfi 5x反應緩沖液10 μL；引物(上游及下游)5 μL；25 mM MgS042 μL，dNTP混合物(每種dNTP 10 mM)1 μL，Tfi DNA 聚合酶(5 U/μL)1 μL；RNA樣品10 μL；AWY 反轉錄酶(5 U/μL)1μL；無核酸酶水12 μL。RT-PCR實驗步驟：將反應體系混勻→48 ℃反轉錄45 min→94 ℃滅活AWV活性后，引物變性2 min→循環開始(94 ℃變性30 s、退火1 min、68 ℃延伸2 min)40個循環，>68 ℃最終延伸7 min→4 ℃保存。200 μg/mLAPS對30 mM高糖處理后HepG2細胞內XBPlmRNA剪切水平(PstⅠ消化法)與XBPlmRNA轉錄水平的影響。

1.2.5 肝細胞核漿蛋白的提取及免疫印跡技術：細胞用PBS換液,在冰上加裂解液裂解,離心取蛋白沉淀，Lowry法測蛋白濃度。取20 μg蛋白于10%SDS-PAGE分離后,轉移至硝酸纖維素膜。然后5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜lh,洗膜后加入兔抗人GSK3β一抗(購自Santa Cruze公司)(1:1000),4 ℃反應過夜，次日洗膜后,加入1:2500辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫孵育1 h，加入ECL顯色劑，X片顯影用QualityOne圖象分析軟件(Bio-Rad公司),根據光密度定量分析。200 μg/mLAPS對30 mM高糖處理后HepG2細胞胞漿及細胞核內GSK3的磷酸化表達檢測，選擇β-actin為內對照。

1.3 實驗分組與處理

① 陰性對照組(C)：3%標準胎牛血清(FBS)的標準高糖 (25 mM) DMEM 培養基作用5 h作為內質網應激陰性對照細胞；②陽性對照組(Tm): 使用衣霉素(tunicamycin，10 μg/mL)處理細胞16 h作為內質網應激陽性對照細胞；③30 mM 高糖誘導組(G30)：3% FBS的30 mM 高糖DMEM培養液，作用5 h；④45 mM高糖誘導組(G45)：3% FBS的45 mM 高糖 DMEM培養液，作用5 h；⑤陰性對照+APS 處理組 (CA)：含200 μg/mLAPS 3%FBS的標準高糖 (25 mM)DMEM 培養基作用24 h；⑥陽性對照+APS 處理組(TA)：含200 μg/mLAPS 3%FBS的標準高糖 (25 mM)DMEM 培養基預處理24 h，更換培養基并加入tunicamycin(10 μg/mL)繼續處理細胞16 h；⑦高糖應激+APS處理組(GA)：含200 μg/mLAPS 3%FBS 的高糖 (30mM)DMEM培養基預處理24 h，換高糖培養基繼續處理細胞5 h。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行實驗數據分析，正態計量資料組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高糖處理建立HepG2 內質網應激細胞模型

2.1.1 不同濃度高糖對HepG2細胞內XBPlmRNA的剪切水平與轉錄水平的影響：與陰性對照組(C)比較，30 mM和45 mM高糖處理細胞5 h，XBP1的轉錄和剪切水平顯著升高(P<0.05)，尤其30 mM 高糖誘導組(G30)XBP1的轉錄和剪切水平顯著升高(P<0.05)，其作用與衣霉素處理組接近(見圖1、圖2)。后續試驗選擇30 mM高糖作為工作糖濃度進一步研究APS的作用。

圖1 不同濃度高糖對HepG2細胞內XBPlmRNA的剪切水平的影響(PstⅠ消化法，n=6)*P<0.05，與C組比較；#P<0.05，與G45組比較Fig.1 Effect of different concentrations of high glucose on shear levels of XBPlmRNA in HepG2 cells (Pst I digestion，n=6)*P<0.05，compared with group C；#P<0.05，compared with group G45

圖2 不同濃度高糖對HepG2細胞內XBPlmRNA轉錄水平的影響(n=6)*P<0.05，與C組比較；#P<0.05，與G45組比較Fig.2 Effect of different concentrations of high glucose on transcription levels of XBPlmRNA in HepG2 cells(n=6)*P<0.05，compared with group C；#P<0.05，compared with group G45

2.1.2 不同濃度高糖對HepG2胞漿及細胞核內GSK3β的活性和核定位的影響：與陰性對照組(C)比較，30 mM高糖誘導組(G30)和45 mM高糖誘導組(G45)，胞漿內GSK3β的磷酸化表達增強及核內定位增強 (P<0.05)，尤其G30組GSK3β的磷酸化表達及核內定位增強最明顯(P<0.05)，其作用與衣霉素處理組接近(見圖3)。

圖3 不同濃度高糖對HepG2細胞胞漿及細胞核內GSK3β的磷酸化表達影響(n=6)*P<0.05，與C組比較；#P<0.05，與G45組比較Fig.3 Effect of different concentrations of high glucose on GSK3β phosphorylation expression in cytoplasm and nucleus of HepG2 cells(n=6)*P<0.05，compared with group C；#P<0.05，compared with group G45

2.2 不同濃度APS對HepG2細胞增殖的影響 MTT實驗結果提示，APS 在50～200 μg/mL范圍內無明顯細胞毒性和促進細胞增殖作用，而400 μg/mL 的APS輕度抑制細胞生長。因此后續試驗選擇最大有效濃度200 μg/mL對細胞進行干預處理。見圖4。

圖4 不同濃度APS對HepG2細胞增殖的影響(MTT法，n=6)*P<0.05，與對照組相比Fig.4 Effect of different concentrations of APS on the proliferation of HepG2 cells (MTT，n=6)*P<0.05，compared with group C

2.3 200 μg/mL APS對高糖處理HepG2 細胞內質網應激反應的影響

2.3.1 200 μg/mL APS對HepG2細胞內XBPlmRNA剪切水平與轉錄水平的影響：與C組相比，CA組細胞內質網應激反應標志物XBP1的轉錄和剪切水平無顯著變化。GA組細胞內質網應激細胞XBP1的轉錄和剪切水平顯著低于30 mM高糖誘導組(G30)(P<0.05)，但TA組與Tm組XBP1的轉錄和剪切水平差異無統計學意義，即APS對Tm 組的內質網應激無顯著影響(見圖5、6)。

圖5 200 μg/mL APS對30 mM高糖處理后HepG2細胞內XBPlmRNA的剪切水平的影響(n=6)*P<0.05，與C組比較；△P<0.05，與GA組比較Fig.5 Effect of 200 μg/mL APS on shear levels of XBPlmRNA in HepG2 cells after high glucose treatment of 30mM(n=6)*P<0.05，compared with group C；△P<0.05，compared with group GA

圖6 200 μg/mL APS對30 mM高糖處理后HepG2細胞內XBPlmRNA的轉錄水平的影響(n=6)*P<0.05，與C組比較；△P<0.05，與GA組比較Fig.6 Effect of 200 μg/mL APS on transcription levels of XBPlmRNA in HepG2 cells after high glucose treatment of 30mM(n=6)*P<0.05，compared with group C；△P<0.05，compared with group GA

2.3.2 200 μg/mL APS對高糖處理HepG2細胞胞漿及核內GSK3β 表達的影響：與G30組比較，GA組胞漿和胞核內GSK3β9 位絲氨酸磷酸化水平顯著增加(P<0.05)，從而抑制GSK3β活性。但與Tm組比較，TA組胞漿和胞核內GSK3β無顯著性變化，見圖7。

圖7 200 μg/mL APS對30 mM濃度高糖處理后HepG2細胞胞漿及核內GSK3β 表達的影響(n=3)*P<0.05，與C組比較；△P<0.05，與GA組比較Fig.7 Effect of 200 μg/mL APS on GSK3β phosphorylation expression of in cytoplasm and nucleus of HepG2 cells after high glucose treatment of 30 mM(n=3)*P<0.05，compared with group C；#P<0.05，compared with group GA

3 討論

黃芪在我國的藥用迄今已有2000多年的歷史，傳統中醫理論認為其具有增強機體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應激、降壓和較廣泛的抗菌作用[6]，但表實邪盛，氣滯濕阻，食積停滯，癰疽初起或潰后熱毒尚盛等實證，陰虛陽亢者均須禁服。隨著現代醫藥科技的發展及體外實驗研究，黃芪中的藥用成分包括黃芪多糖及黃芪皂苷等對腫瘤具有抑制作用，在臨床應用中聯合化療藥物等治療腫瘤可顯著提高療效并改善患者預后，但其具體作用機制尚無明確報道[7-8]。臧文華等[9]構建人肝癌裸鼠原位移植瘤模型，同時給予黃芪-莪術配伍以及聯合順鉑處理，發現黃芪-莪術配伍對人肝癌裸鼠原位移植瘤的生長有抑制作用，且抑制作用與劑量有一定的正相關性，其機制可能與對HIF-1α、VEGF表達的抑制有關，與順鉑合用表現為協同增效和相加作用。陳卓等[10]研究發現黃芪多糖可顯著提高非小細胞肺癌患者放療后T細胞亞群，認為黃芪多糖通過提高機體免疫力而增強非小細胞肺癌三維適形放射治療療效。基于這些證據，目前臨床工作中黃芪包括APS在內的提取物治療惡性腫瘤的應用越來越廣泛，故純化其中抗腫瘤成分并闡明具體抗腫瘤機制對黃芪多糖的進一步應用具有重要意義。

為了明確高糖是否作為獨立的危險因素引起肝臟內質網應激，本研究使用不同濃度高糖誘導細胞發生內質網應激反應。結果發現，30 mM高糖可作為體外工作濃度誘導HepG2細胞出現明顯內質網應激，其作用程度與衣霉素相似。在使用APS預處理細胞24 h后，肝細胞內質網應激反應明顯減輕，APS治療組肝細胞XBP1的轉錄和剪切減少(均P<0.05)。

本研究結果顯示，與G組比較，GA組胞漿和胞核內GSK3β磷酸化水平顯著增加(P<0.05)。推測GSK3β的活性和核定位改變是為了適應體內代謝需要的改變，特別是當內質網對體內未折疊蛋白的處理不足時，GSK3β作為下游信號激酶參與調節細胞調亡、下調蛋白的合成以滿足能量代謝的需要。但是GSK3β活化的同時抑制胰島素信號轉導，加重糖代謝紊亂的發生，這可能是GSK3β所介導的體內一種代償到失代償的過程。關于內質網應激時GSK3β活性和核轉位增強的具體機理還有待于進一步研究。基于本研究的發現，推測APS抑制肝癌細胞增殖可能與其抑制GSK3β蛋白質表達而降低其活性有關，這對闡明APS抑制腫瘤的作用機制具有重要價值。胰島素抵抗時肝臟GSK3β活性和核轉位增強伴隨肝臟內質網應激反應增強。而高糖作為獨立的誘導因素在體外不僅可引起肝細胞發生內質網應激反應，同時本實驗也證實GSK3β 活性和核轉位隨內質網應激反應的活化而增強。

綜上所述，肝細胞內質網應激反應促進高糖情況下肝臟GSK3β的活性及核轉位。經過APS處理后，內質網應激的減輕也伴隨著GSK3β 活性和核轉位的抑制。本研究結果表明:APS 抑制GSK3β 的活性及核轉位在糖穩態的調節中意義重大，而其活性和核轉位的調節與內質網應激的激活有關，2者在作用上的交叉和協同是引起高糖毒性的關鍵。

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(編校：王儼儼)

Antagonism of astragalus polysaccharide on activity and nuclear translocation of glycogen synthase kinase 3β involved in regulation of glucose homeostasis

XU Jun1, ZHANG Si-min1Δ, XUE Jun2, ZHANG Wan-li2, GUO Jian-rong2

(1.Department of Severe Medicine, The Children’s Hospital of Wuhan City, Wuhan 430016, China; 2.Cancer Center, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430023, China)

ObjectiveTo observe the effect of astragalus polysaccharides (APS) on glucose homeostasis regulation and focus on glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3 beta) activity and subcellular localization (nuclear translocation).MethodsHepG2 human hepatoma cells were cultured in vitro and treated with high glucose of different concentrations (30, 40 mM) to induce hepatocyte endoplasmic reticulum stress model, then acquire optimum operating concentration.The HepG2 cells were treated with APS of different concentrations (50, 100, 200, 400 μg/mL) to select the most effective concentration.The HepG2 cells were divided into seven groups with different treatment: negative control group (C), positive control group (Tm), 30 mM high glucose-induced group (G30), 45 mM high glucose-induced group (G45), negative control+APS group (CA), positive control+APS group (TA) and high glucose-induced+APS group (GA).Effect of APS at different concentrations on proliferation activity of HepG2 cells were detected by MTT assay, transcription and shear levels of XBPlmRNA in HepG2 cells by quantitative real-time PCR, and phosphorylation levels of GSK3β in cytoplasm and nucleus by immunoblotting techniques.ResultsThe optimum operating glucose concentration was 30 mM.The most effective APS concentration was 200 μg/mL.The transcription and shear levels of XBPlmRNA in HepG2 cells of GA group were lower than those of G30group (P<0.05), respectively, but there were no significant differences between TA and Tm group.The phosphorylation levels of GSK3β in cytoplasm and nucleus of GA group were higher than those of G group(P<0.05), respectively, but there were no significant differences between TA and Tm group.ConclusionAPS could improve hepatic steatosis, and its mechanism might be that APS inhibits the activity and nuclear localization of GSK3β, then alleviate endoplasmic reticulum stress.

astragalus polysaccharide; glycogen synthase kinase 3β; endoplasmic reticulum stress; HepG2 cells；glucose homeostasis

湖北省自然科學基金面上項目(2012FFB02423)

徐俊，男，本科，副主任醫師，研究方向：兒童重癥疾病診斷與治療，E-mail：xj18571518088@163.com；張思敏，通訊作者，男，本科，住院醫師，研究方向：兒科重癥疾病診斷與治療，E-mail：1468578028@qq.com。

Q591.4

A

1005-1678(2015)06-0035-05