黃芩苷對魚藤酮致BV2細胞激活損傷的影響

馬寶倉，陳忻，張楠

(首都醫科大學 中醫藥學院，北京 100069)

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黃芩苷對魚藤酮致BV2細胞激活損傷的影響

馬寶倉，陳忻Δ，張楠

(首都醫科大學 中醫藥學院，北京 100069)

目的 觀察黃芩苷對魚藤酮致BV2細胞激活損傷的影響。方法 采用MTT法測定魚藤酮染毒BV2細胞存活率、ICC法測定細胞OX42表達變化、熒光分光光度法測定細胞內Ca2+含量、ICP-AES測定細胞內鐵含量以及采用相關試劑盒測定胞外H2O2和胞內MDA、NO、NOS的含量。結果 魚藤酮染毒BV2細胞存活率降低，細胞標記蛋白OX42、細胞內Ca2+含量、細胞內鐵含量顯著增加(P<0.05)，造成細胞產生氧化損傷。黃芩苷可減少魚藤酮染毒BV2細胞OX42表達，增加細胞存活率、減少細胞內鐵含量、減少細胞H2O2釋放，減少氧化損傷(P<0.05)。結論 黃芩苷抑制魚藤酮染毒所致BV2的激活和損傷，具有神經保護作用；其保護作用機制與減少鐵進入細胞有關。

帕金森病；魚藤酮；黃芩苷；小膠質細胞；神經炎癥

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常見的神經退行性疾病。發病機制研究涉及線粒體功能障礙、氧化應激、神經興奮性毒性、神經炎性反應和異常蛋白集聚等諸多學說[1-4]，神經炎性反應與PD發生發展的關系已成為重要的關注熱點之一[5-6]。小膠質細胞作為中樞神經系統的免疫細胞，其活化在神經炎性反應中扮演著重要角色，激活的小膠質細胞[7]通過釋放一系列潛在的神經毒性物質和炎性因子如·OH、NO、O2-、IL-1β和TNF-α等發揮細胞毒性效應[8]，導致繼發性腦損害[9]。PD患者的病理尸檢發現變性的神經元周圍聚集著大量激活的小膠質細胞和星形膠質細胞[10]；在原發性和家族性PD患者均出現大量反應性小膠質細胞[11]。而PD患者黑質(substantia nigra，SN)中鐵含量顯著增加也是一個公認的事實[12-13]，主要病理腦區小膠質細胞的激活，特別是鐵積聚的原因尚未認識清楚。本課題組前期的研究發現魚藤酮PD大鼠不僅黑質致密部，在海馬齒狀回顆粒細胞層、紋狀體蒼白球、小腦齒狀-間位核及面神經核區域都有鐵的顯著積聚[14]，而常用中藥黃芩中的有效成分黃芩苷在改善PD動物神經行為學癥狀的同時，可減少上述區域鐵積聚。研究還見這些區域內小膠質細胞、星型膠質細胞均呈激活狀態[15-16]。這些發現提示小膠質細胞激活與鐵積聚可能存在著的某種關系，本研究旨在：①觀察魚藤酮染毒小膠質細胞所造成的激活和損傷及是否能引起鐵攝入增加，探討小膠質細胞激活和損傷與鐵攝入的關系。②黃芩苷是否能減輕魚藤酮染毒BV2細胞激活及所造成的損傷；能否減少損傷時鐵的攝入，從而探討黃芩苷保護神經細胞的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：BV2小鼠小膠質細胞(國家實驗細胞資源共享平臺)。

1.1.2 藥品與試劑：魚藤酮(ROT，上海阿拉丁，批號：H1206031)，檸檬酸鐵胺(FAC，國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20091029)，阿司匹林(AS，國家標準物質資源中心，批號：CDCT-C10024000)、黃芩苷(BI，中國藥品生物制品檢定所，批號：A0016)，小鼠CD11b/c(OX42)單克隆抗體(Abcam?公司，批號：GR67204-1)，鈣熒光測定試劑盒(CFA，Immuno Way公司，批號：C38T121)。

1.1.3 儀器：AP250D型電子天平(美國奧豪斯)；電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司)；CO2恒溫培養箱(Heraeus Hear cell 150 Thermo)；層流超凈臺(Taisite)；倒置顯微鏡(Leica DMIL)；680型酶標儀(Bio-Rad)；Biofuge15R型低溫生物離心機(Heraeus Instrument)；MIR-162型恒溫培養箱(日本三洋公司)；RF-5301PC熒光分光光度計(Shimadiu, 日本)；ICPS-7000型高頻電感耦合等離子發射光譜儀(ICE-AES)(日本Shimadzu公司)；ECLIPSE80i型顯微鏡(日本Nikon公司)；OLYMPUS IX71熒光倒置顯微鏡(日本)；低溫高速離心機(德國EPPENDORF公司)；pH計(英國JENWAY)。

1.2 方法

1.2.1 魚藤酮對BV2細胞的損傷濃度和時間的確定:采用96孔板，1×104個/mL接種BV2細胞，每孔加入100 μL細胞懸液，培養約24 h，細胞生長至匯合度約在60%～70%時，加入不含血清的DMEM配制的ROT梯度(0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 μmol/L)，分別作用6、12、24 h，每板設正常對照組。時間結束時每孔加20 μL的MTT(濃度為0.5 mg/mL)，4 h后吸棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO，設空白對照組，測定細胞存活率。

1.2.2 BV2細胞損傷后的形態觀察 用24孔板培養BV2細胞，分設正常對照組、黃芩苷組、模型組。待細胞長至匯合度約在60%～70%時，模型組加0.01 μmol/LROT孵育24 h，黃芩苷組先加0.01 μmol/LROT，后加入20 μg/mL的黃芩苷，共同孵育24 h。在相差顯微鏡下觀察各組細胞形態，并拍片記錄，其中模型組在6 h、12 h、24 h時分別觀察記錄。

1.2.3 黃芩苷對魚藤酮染毒BV2細胞存活率的影響:正常傳代培養的BV2細胞，分為正常對照組、ROT模型組、ROT+BI組(BI組)、ROT+AS組(AS組)。接種細胞匯合至60%～70%時，BI組(BI1、BI2、BI3)和AS組(AS1、AS2、AS3)分別用無血清的梯度BI(10、20、50 μg/mL)、AS(0.1、1、10 mmol/L)先孵育1h，正常對照組和ROT模型組則加無血清DMEM培養液。后各組除正常對照組均加ROT(終濃度為0.01 μmol/L)孵育24 h。MTT法測各組細胞存活率。

1.2.4 黃芩苷對魚藤酮染毒BV2細胞激活的影響:將BV2細胞懸液(1×104個/mL)2 mL接種于放置涂有多聚賴氨酸的蓋玻片的24孔板里培養24 h，分為4組。BI組和AS組分別用無血清的BI(20 μg/mL)、AS(1 mmol/L)先孵育1 h，正常對照組和ROT模型組則加無血清DMEM培養液，后除正常組外其余各組加ROT(終濃度為0.01 μmol/L)孵育24 h制成細胞涂片。行OX42染色：細胞涂片、4%多聚甲醛固定、3%H2O2清除內源性過氧化物酶、羊血清封閉液、滴加OX42(1:100)抗體、4 ℃過夜、按順序滴加二抗、DAB顯色、梯度乙醇脫水、二甲苯脫水、封片。每組6復孔。

1.2.5 黃芩苷對魚藤酮染毒BV2細胞內鈣離子的影響：細胞培養及分組同1.2.4。收集細胞，參照Grynkiewiez等[17]的方法測定各組細胞Ca2+濃度。

1.2.6 黃芩苷對魚藤酮染毒BV2細胞自由基代謝的影響：細胞培養及分組同1.2.4。吸出上清液，4000 r/min，離心5 min，吸出上清于2 mL的離心管中，4 ℃放置，待測。按南京建成生物工程研究所試劑盒提供的方法進行檢測。每組6復孔。

1.2.7 黃芩苷對魚藤酮染毒BV2細胞胞內鐵濃度的影響：將密度為1×104個/mL的BV2細胞2 mL/孔鋪到6孔板中，分為5個組：正常對照組、檸檬酸鐵胺組(FAC)、ROT模型組(FAC+ROT)、BI組(FAC+ROT+BI)、DFO組(FAC+ROT+DFO)。待細胞匯集度為60%～70%時，吸棄培養液，ROT組、BI組、DFO組均加用無血清的DMEM配置的含FAC的ROT，FAC、ROT的終濃度分別為10、0.01 μmol/L，FAC組只加用無血清的DMEM配制的終濃度為10 μg/mL的FAC，正常對照組加相應量的無血清的DMEM培養液；培養24 h后，BI組和DFO組分別加終濃度為20、50 μg/mL的BI和DFO，其余各組組加無血清DMEM培養液，2 mL/孔，共同孵育3 h。收集細胞、計數，每組復9孔。高頻電感耦合等離子發射光譜儀檢測細胞內鐵含量[18]。

1.2.8 圖像分析：每組取6張細胞爬片，40倍鏡采集圖像，用NIS-Elements病理圖像分析系統(Ver.2.1)分析積分光密度(IOD)。

2 結果

2.1 黃芩苷對魚藤酮染毒所致BV2細胞損傷的保護作用

2.1.1 魚藤酮對BV2細胞的損傷呈現出劑量依賴性：結果顯示：ROT分別染毒BV2細胞6、12、24 h，ROT分別在0.05～0.5、0.01～0.5、0.005～0.5 μmol/L濃度區間，顯著地抑制細胞增殖。魚藤酮染毒12 h與染毒6 h相比，染毒細胞形態發生明顯變化，但細胞數量增加；染毒至24 h與染毒12 h相比，不但細胞形態發生了變化，細胞數目也明顯減少。在染毒24 h的ROT濃度梯度中，0.01 μmol/L染毒組即可造成BV2細胞與正常對照組差異有統計學意義，因此本實驗其他指標中染毒組即采用此濃度。見表1。

表1 魚藤酮梯度濃度及不同作用時間對BV2細胞存活率的影響±s，n=6)Tab.1 Influence of Rotenone gradient concentration and different duration for BV2 cells survival ±s，n=6)

*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與6 h比較，compared with 6 h

2.1.2 ROT染毒BV2細胞后其形態的變化:正常組細胞絕大部分為圓形或橢圓形；模型組作用BV2細胞，前6 h內無顯著性變化，6～12 h內大部分細胞可產生樹突，24 h時，樹突大量減少，大部分細胞呈現不規則圓形，較正常組細胞胞體變大，細胞邊緣透明化程度增高；黃芩苷組樹突較少，細胞形態接近正常對照組。見圖1。

圖1 BV2細胞受到ROT影響時的細胞形態(×20)Fig.1 BV2 cell morphology by ROT influence(×20)

2.1.3 黃芩苷對魚藤酮染毒的BV2細胞具有劑量依賴性的保護作用:黃芩苷在10～50 μg/mL濃度范圍，可減少魚藤酮(0.01 μmol/L，24 h)染毒BV2細胞的死亡率，對BV2細胞的保護呈現出劑量依賴性，而AS過低濃度保護作用不強，過高濃度則會引進新的損傷。見表2。

表2 黃芩苷對魚藤酮染毒BV2細胞死亡率的影響±s，n=6)Tab.3 Effect of baicalin on rotenone exposure BV2 cells ±s，n=6)

**P<0.01，與正常組比較，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.2 黃芩苷減少魚藤酮染毒所致BV2細胞的激活 實驗結果顯示：魚藤酮模型組較正常組BV2細胞OX42的表達顯著增加，BI組與AS組較模型組OX42的表達減少，提示ROT激活BV2細胞，而BI和AS可以減少魚藤酮導致的BV2激活，且BI優于AS。見表3、圖2。

表3 魚藤酮染毒BV2細胞OX42的表達Tab.

**P<0.01，與正常組比較，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較，compared with model group

圖2 魚藤酮染毒BV2細胞OX42的表達(×100)Fig.2 Rotenone exposure BV2 cells express OX42(×100)

2.3 黃芩苷減少魚藤酮染毒BV2細胞內鈣離子濃度 結果顯示，ROT模型組細胞內Ca2+含量顯著增加(P<0.01)。而BI、AS能夠明顯抑制魚藤酮染毒引起的細胞外液中Ca2+的進入。見表4。

表4 魚藤酮染毒BV2細胞Ca2+含量變化Tab.4 Ca2+ content changes of rotenone infected BV2 ±s，n=6)

*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較，compared with control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with model group

2.4 黃芩苷抑制魚藤酮染毒BV2細胞氧自由基產生及氧化損傷 BV2細胞在0.01 μmol/L的ROT干預24 h后，ROT模型組細胞培養液中H2O2含量、BV2細胞MDA、NO、NOS含量均明顯高于對照組(P<0.01)，而BI組和AS組均能降低ROT染毒所造成的BV2細胞的氧化損傷，降低細胞培養液中H2O2的含量(P<0.01)，降低細胞內MDA、NO、NOS的量(P<0.05)。見表5。

組別H2O2(mmol/L)MDA(nmol/mgprot)NO(μmol/L)NOS(U/mgprot)正常對照組7.24±1.456.35±1.438.52±1.4111.52±2.07ROT模型組36.60±6.05**18.99±3.23**77.54±8.32**65.51±6.72**BI組27.06±4.70##9.72±1.63##28.46±7.28##33.46±5.26##AS組30.50±4.91#12.88±1.69#30.60±6.73##31.36±5.68##

**P<0.01，與正常組比較，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.5 黃芩苷減少魚藤酮染毒BV2細胞內鐵含量 結果顯示，FAC組和ROT組細胞內鐵含量較正常組有顯著差異(P<0.01)，提示鐵的擴散受濃度梯度驅使，很容易進入細胞。黃芩苷組和去鐵胺組細胞內的鐵較模型組顯著減少(P<0.05)，表明黃芩苷、去鐵胺都能減少鐵進入BV2細胞內。而魚藤酮染毒并沒有使BV2細胞內鐵含量增加。見表6。

表6 電感耦合等離子發射光譜法測定魚藤酮染毒BV2細胞內鐵含量Tab.6 Inductively coupled plasma emission spectrometry determination of rotenone infected BV2 iron content in the ±s，n=6).

*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較，compared with model group

3 討論

1988年，McGeer等[19]在PD患者中腦黑質致密帶中發現了激活的Mi。激活的小膠質細胞膜表面分子也呈現上調改變[20]，能夠產生和分泌一系列炎癥介質，這些炎癥介質不僅調節免疫活性，而且作用于神經元，發揮細胞毒性作用，損傷多巴胺神經元[21-22]。本研究在小鼠小膠質細胞株BV2細胞上，以魚藤酮誘導BV2細胞激活，建立了穩定的PD小膠質細胞模型。

PD神經病理學機制的氧化應激學說已獲共識，氧化應激學說與炎性反應、線粒體功能障礙等其他學說之間密切關聯[23]，氧應激損傷處于各種學說關聯的樞紐位置，而鐵參與Fenton反應，是促進氧應激反應的重要金屬離子。魚藤酮是線粒體復合酶Ⅰ抑制劑，對神經細胞的損傷除了能量代謝障礙機制外也有氧應激的參與，復合物Ⅰ抑制誘導產生大量活性氧可引起復合物Ⅰ活性持續下降，形成惡性循環[24]。

本項研究顯示，魚藤酮0.005～0.5 μmoL/L范圍內均可造成BV2細胞不同程度的損傷，且損傷呈現出劑量的依賴性；魚藤酮染毒后的BV2細胞先會看到樹突明顯增加，而后細胞呈現出胞體變大、樹突減少的阿米巴樣的激活狀態，同時標志蛋白OX42表達顯著增加，呈現顯著的激活狀態；激活意味著炎性釋放增加，意味著后繼的炎性級聯反應啟動。本研究結果顯示魚藤酮顯著抑制了BV2增殖、使細胞內Ca2+增加，釋放H2O2增加、細胞氧化損傷加劇；還首次觀察到黃芩苷具有抑制魚藤酮染毒BV2細胞激活的作用；魚藤酮能夠減少染毒細胞的死亡率；抑制細胞內Ca2+增加；減少釋放H2O2；抑制細胞氧化損傷，從而對神經細胞產生保護作用。這為闡釋黃芩苷在PD動物模型上呈現的神經保護作用機制提供了更多的證據。

一直以來被臨床研究[25]和實驗研究[26-31]不斷證明，PD患者或動物腦內存在鐵積聚，鐵積聚與PD發生發展的關系是亟待認識的問題，也正在引起臨床研究的關注。Kirsch[32]在對輕度認知功能損害患者近2年隨訪研究中發現：認知功能下降與腦內鐵含量的異常沉積增多密切相關。有研究將鐵鰲合劑去鐵胺維持治療可減緩AD患者的癡呆發展速度[33]。從鐵代謝紊亂入手，用鐵螯合劑治療AD、PD正在形成一種新思路。

本研究在BV2細胞上探索了魚藤酮、小膠質細胞激活、細胞鐵攝入增加之間的關系，發現在有少量鐵負載情況下，魚藤酮染毒并沒有顯著增加細胞內鐵的含量；這提示魚藤酮并不能直接導致鐵更多地進入細胞，也即指出環境毒素可能不直接引起鐵在腦區積聚；而鐵負載對照組的結果指出：鐵在細胞內外濃度梯度存在下能夠進入細胞；這提示在整體情況下發生的可能是：環境因素造成神經細胞出現損傷的腦區，有某種因素驅動著鐵的集聚，在集聚所形成的濃度梯度下鐵更多地進入損傷后正在修復的細胞和幸存的細胞，通過加劇Fenton反應，造成進一步損傷，致使損傷的發展，可能存在著惡性循環。本課題組[15]前期研究發現鐵的積聚是逐漸發展的，顯著積聚是發生在小膠質細胞激活之后、造模成功后8周，將魚藤酮PD大鼠造模成功后繼續喂養2年，見其黑質鐵積聚的程度已是造模成功時的數倍，這些研究支持上述推測。認識驅動鐵集聚的因素可能是進一步需要深入工作的方向，多種神經退行性疾病都存在腦鐵異常積聚，搞清鐵積聚的驅動因素可能對認識疾病的發展、尋找新思路的藥物意義重大。本項研究還觀察到減少鐵離子進入細胞內可能是黃芩苷產生神經保護作用的主要機制之一。藥理研究早已證實黃芩苷有抗炎、抗氧化、抗癌、抗病原體、抗心律失常、調節血脂、調節免疫、解熱、鎮靜、激活血管內皮生長因子表達等多種活性，黃芩苷分子具有黃酮類母核結構，它的結構決定了它有很好的金屬離子螯合性[34-35]，課題組前期在C6細胞證實了黃芩苷可通過螯合鐵離子調節膜轉鐵蛋白DMT1、FP1的表達，減少鐵離子的攝入，抑制了鐵誘導的氧應激和脂質過氧化水平，抑制細胞凋亡，對神經細胞起到保護作用[36]。本研究的結果進一步提示黃芩苷作為金屬離子螯合劑可能在治療與鐵積聚有關的神經退行性疾病中具有重要意義。

[1] Riley BE,Olzmann JA.A polyubiquitin chain reaction:parkin recruitment to damaged mitochondria[J].PLoS Genet, 2015,11(1):e1004952.

[2] Okazawa H,Ikawa M,Tsujikawa T,et al.Brain imaging for oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases[J].Q J Nucl Med Mol Imaging, 2014,58(4):387-397.

[3] Markopoulou K,Biernacka JM,Armasu SM,et al.Does α-synuclein have a dual and opposing effect in preclinical vs.clinical parkinson’s disease?[J].Parkinsonism Relat Disord, 2014,20(6):584-589.

[4] Nalls MA,Saad M,Noyce AJ,et al.Genetic comorbidities in parkinson’s disease[J].Hum Mol Genet, 2014,23(3):831-841.

[5] 焦方陽，吳平，左傳濤.小膠質細胞顯像原理及其在帕金森病和阿爾茨海默病的應用[J].中國臨床神經科學，2014，22 (6)：686-693.

[6] Deleidi M,Gasser T.The role of inflammation in sporadic and familial parkinson’s disease[J].Cell Mol Life Sci, 2013,70(22):4259-4273.

[7] Heales SJ,Lam AA,Duncan AJ,et al.Neurodegeneration or neuroprotection:the pivotal role of astrocytes[J].Neurochem Res, 2004,29(3):513-519.

[8] Davalos D,Grutzendler J,Yang G,et al.ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo[J].Nat Neurosci,2005,8(6):752-758.

[9] Garden GA,Moller T.Microglia biology in health and disease[J].J Neuroimmune Pharmacol,2006,1(2):127-137.

[10] McGeer PL,Itagaki S,Boyes BE,et al.Reactive microglia are positive for HLA-DR in the substantia nigra of parkinson’s and Alzheimer’s disease brains[J].Neurology,1988,38(8):1285-1291.

[11] Chen X,Zhang N,Li C,et al.parallel relationship between microglial activation and substantia nigra damage in a rotenone-induced parkinson’s disease rat model[J].Neural Regen Res,2010,5(4):245-250.

[12] 熊珮，陳忻.黃芩苷對帕金森病大鼠多腦區鐵積聚及黑質DMT1、FP1的影響[D].北京：首都醫科大學，2013.

[13] 王俊，宋寧，徐華敏.帕金森病中鐵與α-突觸核蛋白的相互作用[J].生理科學進展，2015，46(3)：182-184.

[14] Xiong P,Chen X,Guo CY.Baicalin and deferoxamine alleviate iron accumulation in different brain regions of parkinson’s disease rats[J].Neural Regen Res,2012,7(27):2092-2098.

[15] Pisanu A,Lecca D,Mulas G,et al.Dynamic changes in pro-and anti-inflammatory cytokines in microglia after PPAR-γ agonist neuroprotective treatment in the MPTPp mouse model of progressive Parkinson’s disease[J].Neurobiol Dis, 2014,71:280-291.

[16] 馬寶倉，陳忻，熊珮，等.魚藤酮帕金森大鼠多腦區鐵積聚與膠質細胞激活[J].中國實驗動物學報，2013，21(6)：41-45.

[17] Grynkiewicz G,poeine M,TsienRY.A new generation of Ca2+indicators with Greatly improved fluorescence properties[J].J Biol Chem,1985,260(6):3440-3450.

[18] Guo CY, Chen X.Baicalin interferes with iron accumulation in C6 glioma Cells[J].Neural Regen Res,2011,6(30):2352-2356.

[19] McGeer PL,Itagaki S,Boyes BE,et al.Reactive microglia are positive for HLA-DR in the substantia nigra of parkinson,s and Alzheimer,s disease brains[J].Neurology,1988 ,38(8):1285-1291.

[20] Cho BP,Song DY,Sugama S,et al.Pathological dynamics of activated microglia following medial forebrain bundle transection[J].Glia,2006,53(1):92-102.

[21] Floden AM,Li S.Combs CK.Beta-amyloid-stimulated microglia induce neuron death via synergistic stimulation of tumor necrosis factor alpha and NMDA receptors[J].J Neurosci,2005,25(10):2566-2575.

[22] Zheng HF,Yang YP,Hu LF,et al.Autophagic impairment contributes to systemic inflammation-induced dopaminergic neuron loss in the midbrain[J].PLoS One,2013,8(8):e70472.

[23] 陳忻，郭春彥，熊珮.中藥治療帕金森病的用藥概況及其藥理作用分析[J].中藥新藥與臨床藥理，2012，23(6)：690-695.

[24] Tada Oikawa S,Hiraku Y,Kawanishi M,et al.Mechanism for generation of hydrogen peroxide and change of mitochondrial membrane potential during rotenone-induced apoptosis[J].Life Sciences,2003,73:277-3288.

[25] 汪昕.腦鐵沉積、外周鐵過載與認知功能障礙研究進展[J].生理學研究，2013(1)：16-19.

[26] Glinka Y,Gassen M,Youdim MB.Mechanism of 6-hydroxydopamine neurotoxicity[J].J Neural Transm Suppl,1997,50:55-66.

[27] 楊海東，林碧蓮.人參皂苷Rg1拮抗MPTP誘導小鼠黑質中鐵增高的作用[J].山西醫科大學學報，2011，(1)：10-14.

[28] 霍潔，魯強，徐群淵等.大鼠蒼白球炎癥反應后黑質鐵代謝的改變[J].中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(8)：1489-1496.

[29] 東春陽.魚藤酮對大鼠黑質多巴胺能神經元的影響及其與鐵的聯合作用[D].上海：華東師范大學，2008.

[30] Song YW, Chen X, Li C,et al.Divalent metal transporter1 expression and iron deposition in the substantia nigra of a rat model of parkinson’s disease[J].Neural Regen Res,2010,5(22):1701-1705.

[31] 宋揚文，陳忻，張楠，等.黃芩苷抑制魚藤酮帕金森病大鼠黑質鐵積聚及作用機制[J].中國藥理學通報，2011，27(12)：1740-1744.

[32] Kirsc W.Serial susceptibility weighted MRI measures brian iron and microbleeds in dementia[J].Alzheimers Dis,2009,17(3):599-609.

[33].Crapper MD.Intramuscular desferrioxamine in patients with Alzheimer’s Disease[J].Lancer,1991,337(8753):1304-1308.

[34] Pu YM,Wang Q,Qian ZM.Effect of iron and lipid peroxidation on development of cerebellar granule cells in vitro[J].Neuroscience,1999,89(3):855-861.

[35] Shimizu I,Ma YR,Mizobuchi Y,et al.Effects of Sho-saiko-to a Japanese herbalmedicine on hepatic fibrosis in rats[J].Hepatology,1999,29(1):149.

[36] Guo CY, Chen X, Xiong P.Baicalin suppresses iron accumulation after substantia nigra injury:relaiongship between iron concentration and transferrin expression[J].Neural Regen Res,2014,9(9):630-636.

(編校：譚玲)

Effect of baicalin on BV2 cell activation damage caused by rotenone

MA Bao-cang, CHEN XinΔ, ZHANG Nan

(School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069)

ObjectiveTo observe Effect of baicalin on BV2 cell activation damage caused by rotenone.MethodsRotenone infected BV2 cell viability were detected by MTT assay, and OX42expression by ICC method assay, the inner cell Ca2+content by fluorescence spectrophotometry, intracellular iron content by ICP-AES when low concentrations iron of load without damage in cells and extracellular H2O2and intracellular content of MDA, NO, NOS with related kits.ResultsRotenone exposure BV2 cell reduced cell viability, the expression of cell marker protein OX42and intracellular Ca2+content and intracellular iron content were all significantly increased(P<0.05), resulting in oxidative damage to cells. Baicalin reduced OX42expression of rotenone exposure BV2 cell, increased cells survival, reduced intracellular iron content and H2O2release and oxidative damage of BV2(P<0.05).ConclusionBaicalin inhibits BV2 activation and damage by rotenone-induced, and it has neuroprotective effects. The protection mechanism may relate to reduce iron into cells.

Parkinson’s disease; rotenone; baicalin; microglial cells; nerve inflammation

2011年北京市教委科技發展計劃項目(KM201110025010)

馬寶倉，男，碩士，助教，研究方向：中藥防治帕金森病的基礎研究，E-mail：mbcbeijing20081125@163.com；陳忻，通訊作者，女，本科，教授，研究方向：中藥防治帕金森病的基礎研究、中藥藥理的教學與科研， E-mail：chenxin4283@126.com。

R3

A

1005-1678(2015)08-0001-05