國產烏司他丁對絲氨酸蛋白酶抑制效果的體外研究

陳健文，張仁偉，溫煒杰，黎思彤，劉翠，劉培慶，李民

(中山大學 藥學院 新藥篩選中心，廣州 510006)

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國產烏司他丁對絲氨酸蛋白酶抑制效果的體外研究

陳健文，張仁偉，溫煒杰，黎思彤，劉翠，劉培慶，李民Δ

(中山大學 藥學院 新藥篩選中心，廣州 510006)

目的 系統比較國產烏司他丁對凝血和抗凝血系統中的凝血因子10、纖溶酶、凝血酶、激肽原酶以及多形核粒細胞彈性蛋白酶活性的抑制效果，為臨床研究的劑量選擇提供依據。方法 設計合成生色底物，分別采用靈敏的熒光檢測方法，優化反應過程酶和底物的濃度。采用多點法測定并計算烏司他丁對各種絲氨酸蛋白酶的半數抑制率。結果 烏司他丁可以明顯抑制多型核粒細胞彈性蛋白酶(polymorphonuclear leukocyte elastase，PMNE)和纖溶酶，IC50均低于100 U/mL。對凝血因子Xa以及激肽原酶抑制均高于1000U/mL，但對凝血酶無抑制作用。結論 國產烏司他丁對PMNE的抑制效果最強，與日本同類產品對這幾種絲氨酸蛋白酶的抑制效果相似，為其在抗炎、抗凝、促凝及抗休克效果中選擇合適的劑量區間提供了可靠數據。

烏司他丁；抗凝血；絲氨酸蛋白酶；熒光檢測

在哺乳類動物里面，絲氨酸蛋白酶扮演著很重要的角色，特別是在消化，凝血和補體系統方面。凝血因子X(Factor Xa)，是參與內源性和外源性凝血途徑的一種耐貯存因子。缺乏可致系統性凝血障礙。凝血第11因子，即是血漿凝血酶活酶前質作用于內源性凝血途徑的一種穩定因子，缺乏這種因子會引起系統性血凝缺陷。凝血酶來自凝血酶原，可促使纖維蛋白原變為纖維蛋白的酶。纖維蛋白溶酶是溶解纖維蛋白或血凝塊系統的有效部分，是對纖維蛋白有高度特異性的蛋白分解酶，對已經形成的纖維蛋白凝塊有特別的溶解力，對其他血漿蛋白、凝固因子和一般蛋白質也有類似作用[1-3]。急性胰腺炎是胰酶大量釋放激活并誘導細胞因子釋放，進而導致胰腺組織的自身嚴重破壞，并可能危及其他重要器官的一種疾病。休克或體外循環手術等循環障礙時，機體產生大量內毒素，大量巨噬細胞和中性粒細胞聚集，細胞溶酶體膜被破壞，釋放大量蛋白酶，如中性粒細胞彈性蛋白酶、各種組織蛋白酶、膠原酶、血漿酶原激活因子、類胰蛋白酶等，具有很強的損壞作用，烏司他丁可以抑制上述蛋白酶的活性，因此在生理上和藥理上都有重要意義[4-6]。

烏司他丁為新鮮人尿中提取的一種能抑制多種蛋白水解酶活力的酸性糖蛋白。含有143個氨基酸，分子量約67 000道爾頓。烏司他丁存在2個Kunitz結構域，對絲氨酸蛋白酶有抑制作用，參與凝血、纖維蛋白溶解、補體激活、炎癥反應及組織重建過程。Kunitz結構域可抑制彈性蛋白酶、凝血因子V、VIII、XIII、Xa、纖溶酶、激肽原酶等活性[7-8]。烏司他丁除對多種蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制作用外，還能改善休克時的循環狀態，對溶酶體膜有穩定作用，抑制炎癥介質的釋放等功能。大量的臨床研究表明烏司他丁在治療急性胰腺炎、膿毒癥、減少體外循環并發癥、減輕手術對器官的損傷、預防腫瘤化療引起腎毒性等方面顯示出極好的療效和較強的臟器功能保護作用[9-11]。

本研究旨在通過體外測定國產烏司他丁對多形核粒細胞彈性蛋白酶、凝血因子Xa、纖溶酶、凝血酶、激肽原酶的IC50，了解烏司他丁對這些絲氨酸蛋白酶的抑制能力差異，為該藥物在抗炎、抗凝/促凝及抗休克效果的劑量區間以及動物研究和臨床研究劑量提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 凝血酶(Thrombin, bovine)購自上海經科化學科技有限公司(貨號JK-034-1000U)；纖溶酶(Plasmin, human)購自Biovision(貨號4089-1000)；凝血因子X(Factor Xa)購自艾德豪克國際技術有限公司(貨號AG00-0121)；激肽原酶(Kallikrein)購自生工生物工程上海有限公司(貨號KB0545)；多形核粒細胞彈性蛋白酶(Polymorphonuclear leukocyte elastase，PMNE)購自Innovative Research(貨號IHNE)；多肽S-2266(貨號P130514-MY352502)、S2238(貨號P130514-MY352505)、S2765(貨號P130514-MY302220)、S2251(貨號P130514-MY245955)均購自吉爾生化(上海)有限公司；MeOSuc-AAPV-AMC購自Enzo life sciences(貨號BML-P224-0005)；注射用烏司他丁由廣東天普生化醫藥股份有限公司提供(凍干粉，10萬U/瓶，批號021110031)；DMSO購自MP Biomedicals(貨號196055)。其他相關試劑均購自生工生物工程上海有限公司。

1.2 實驗儀器 酶學反應檢測采用多功能酶標儀工作站Tecan Infinite2000(Tecan，瑞士)；96孔白板(Corning，美國)。溶液配制用水使用純水機Millipore-Q-Synthesis(Millipore Ltd.，法國)；恒溫采用金屬浴水立方(金銀杏生物科技有限公司，北京)。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制:反應緩沖體系為Tris buffer(Tris 50 mM，NaCl 150 mM，pH 8.0)。各蛋白酶和烏司他丁均用此溶液配制。母液配制濃度分別為：烏司他丁母液為100 U/μL；凝血酶母液為1.25 IU/mL；凝血因子Xa母液為1.25 U/mL；激肽原酶母液為10 mg/mL；纖溶酶母液為2 mg/mL；PMNE母液1 μg/mL。各多肽生色底物采用DMSO溶解配制，母液為10 mM。

1.3.2 反應條件的優化：本實驗反應采用2種基于不同96孔板的方法測定。一種為針對凝血因子X、凝血酶、纖溶酶、激肽原酶在405 nm波長下的吸收值變化，采用底部透明的96孔板；另一種為針對彈性蛋白酶和PMNE的熒光檢測，激發波長380 nm，發射波長460 nm，采用白色不透明96孔板。反應體系均為200 μL/孔。實時檢測熒光變化，根據反應結束時的OD在10000～2000之間，確定底物濃度。固定濃度的底物再與蛋白酶孵育反應，根據達到最大反應效果的時間約30 min，確定蛋白酶的濃度。

1.3.3 酶反應的測定：根據所確定的反應條件，各蛋白酶與烏司他丁在37 ℃混合孵育20 min，然后加入底物，連續讀取熒光變化。截取20 min內的線性部分計算酶反應的斜率，以抑制前后的斜率變化百分比作為抑制率，進而計算烏司他丁抑制不同蛋白酶的效果(IC50)。所有蛋白酶的抑制測定均按照如上步驟進行。抑制劑烏司他丁為100000 U/mL，反應最終體積均為200 μL。各類蛋白酶的測定均重復3次，用于結果計算。

2 結果

2.1 各蛋白酶與底物反應濃度的確定 通過檢測最大熒光吸收即OD405 nm在1.0～1.5之間，確定了凝血因子X、凝血酶、纖溶酶、激肽原酶對應的底物濃度。見表1。通過檢測最大熒光強度，確定在20000左右，采用激發波長為380 nm，發射波長為460 nm，得到PMNE的最適反應底物濃度。在37 ℃反應條件下，各反應最適條件總結見表1。

表1 各蛋白酶與其底物的最適反應條件Tab.1 Optimum concentration for each enzymes and substrates

2.2 烏司他丁對凝血因子Xa活性的抑制效果 在預實驗中得到凝血因子Xa的最佳作用底物濃度和蛋白濃度分別為底物0.3 mM，酶0.01 U/mL(見表1)。在此條件下改變抑制劑烏司他丁的濃度(0～5000 U)，根據單位時間的熒光變化計算反應速率。測得烏司他丁對凝血因子10的半數抑制濃度IC50為310 U(見圖1)，即1550 U/mL。

圖1 烏司他丁抑制凝血因子Xa的IC50測定Fig.1 IC50 measurement of Ulinastatin on inhibition of Factor Xa

2.3 烏司他丁對激肽原酶活性的抑制效果 在預實驗中得到激肽原酶的最佳作用底物濃度和蛋白濃度為底物0.35 mM，酶75 μg/mL(見表1)。在此條件下改變抑制劑烏司他丁濃度(0～15000 U)，計算反應速率。測得烏司他丁對激肽原酶的半數抑制濃度IC50為2010 U(見圖2)，即10050 U/mL。

圖2 烏司他丁抑制激肽原酶的IC50測定Fig.2 IC50 measurement of Ulinastatin on inhibition of kallikrein

2.4 烏司他丁對纖溶酶活性的抑制效果 在預實驗中得到纖溶酶的最佳作用底物濃度和蛋白濃度為底物0.35 mM，酶8 μg/mL(見表1)。在此條件下改變抑制劑烏司他丁濃度(0～1000 U)，計算反應速率。測得烏司他丁對纖溶酶的半數抑制濃度IC50為14.1 U(見圖3)，即70.5 U/mL。

圖3 烏司他丁抑制纖溶酶的IC50測定Fig.3 IC50 measurement of Ulinastatin on inhibition of plasmin

2.5 烏司他丁對PMNE以及彈性蛋白酶活性的抑制效果 在預實驗中得到PMNE的最佳作用底物濃度和蛋白濃度為底物0.1 mM，酶75 ng/mL(見表1)。在此條件下改變抑制劑烏司他丁濃度(0～20 U)，計算反應速率。測得烏司他丁對PMNE的半數抑制濃度IC50為0.53 U(見圖4)，即2.65 U/mL。

圖4 烏司他丁抑制PMNE的IC50測定Fig.4 IC50 measurement of Ulinastatin on inhibition of PMNE

2.6 烏司他丁對凝血酶活性的抑制效果 選擇凝血酶非特異性抑制劑PMSF進行對照，檢驗反應體系的抑制效率，可以測得PMSF對凝血酶的半數抑制IC50為0.46 mM(見圖5)，表明反應體系可靠。在相同實驗條件下，配制烏司他丁最大濃度在15000 U，即75000 U/mL時，對凝血酶抑制率僅為98%，由于用量超出給藥范圍，因此無法計算IC50。即烏司他丁對凝血酶無抑制作用。

圖5 PMSF抑制凝血酶的IC50測定Fig.5 IC50 measurement of Ulinastatin on inhibition of thrombin

2.7 比較國產和日產烏司他丁對酶的抑制能力 在本實驗條件下，烏司他丁可以明顯抑制多型核粒細胞彈性蛋白酶(PMNE)和纖溶酶，IC50均低于100 U/mL。對凝血因子X以及激肽原酶抑制均高于1000 U/mL，但對凝血酶沒有抑制作用。與日本持田公司同類產品(Miraclid)對各絲氨酸蛋白酶的抑制趨勢相似[18]，即不同來源烏司他丁均對PMNE表現出最強的的抑制效果(見表2)。

表2 烏司他丁對不同絲氨酸蛋白酶的抑制能力Tab.2 Comparation of the inhibitory effect of different Ulinastatin products against serine proteases

3 討論

凝血過程包括內源性凝血途徑和外源性凝血途徑，其中凝血因子X激活為Xa是內外源性凝血的共同途徑，抑制凝血因子X的激活能同時抑制內外源性凝血[12]。激肽原酶裂解激肽原，形成緩激肽和胰激肽，使血管擴張，血壓下降。有研究提示烏司他丁可能通過抑制激肽釋放酶，使血壓回升[13]。體內凝血和纖溶兩系統是相互依存緊密相聯的。機體一旦產生凝血反應，也幾乎同時激活了纖溶系統，使體內多余的血栓移去，從而避免纖維蛋白的過多凝聚。纖溶過程中，最關鍵的環節是纖溶酶原被激活為纖溶酶，作用于凝血塊中的纖維蛋白，使其溶解[14]。體內粒細胞彈性蛋白酶及其內源性抑制劑的平衡失調可導致組織基質降解和炎癥的惡化。基礎和臨床研究提示，烏司他丁可抑制中性粒細胞彈性蛋白酶活性，減輕炎癥反應和組織損傷[15-16]。凝血酶的生理功能與其絲氨酸蛋白酶的活性有關，能裂解纖維蛋白原而形成纖維蛋白凝塊，從而促進血液凝塊的形成。凝血酶在體內以凝血酶原形式存在。在凝血過程中凝血酶原復合物將其激活而轉變為有絲氨酸蛋白類水解活性的凝血酶[17]。本研究系統檢測了國產烏司他丁對凝血和抗凝血系統關鍵絲氨酸蛋白酶的抑制作用。實驗采用的是生色底物方法，此方法靈敏度高，特異性好，操作方便，同時也便于在同一反應條件下比較抑制效率。由于日本同類產品的IC50未標明具體底物和方法，暫無法橫向比較不同來源的烏司他丁對同一蛋白酶的效果。本研究為確定國產烏司他丁抗炎、抗凝、促凝及抗休克效果的劑量區間，進而為動物研究和臨床研究劑量選擇提供了可靠數據。

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(編校：吳茜，譚玲)

《中國生化藥物雜志》 2015年全體編委會會議紀要

《中國生化藥物雜志》2015年編委會于2015年7月29日在北京順利召開。包括主編和9位副主編在內的57位編委成員和《中國生化藥物雜志》編輯部全體成員出席會議。

本次會議由《中國生化藥物雜志》主編詹啟敏院士主持。大家聽取了編輯部主任黃景新對《中國生化藥物雜志》2014年復刊以來的工作的總結；責任編輯吳茜演示了官網審稿流程；編委們對《中國生化藥物雜志》編委會章程草案進行了簡單討論；對如何更好地提高《中國生化藥物雜志》刊物質量，以及爭取早日重返我國核心期刊名單，入選CSCD數據庫等展開了熱烈討論。與會編委一致認為：清晰、獨特的雜志定位與獲取高質量的稿件是雜志未來發展的關鍵，大家就如何更好地豐富期刊內容、形成自身特色、拓寬優秀稿源途徑等提出大量很好的意見和建議。

主編詹啟敏院士在總結發言中充分肯定了編輯部的工作，并對各編委提出的意見和建議給予了高度評價。他明確指出：雜志的發展不能僅僅依靠編輯部，還要借助編委會專家團隊的力量，多方形成合力，才能起到強有力的推動作用。詹院士坦言，盡管已經取得了一定進步，但雜志質量還有很大的提升空間，做雜志就是建設一個系統工程，每一個環節都至關重要。他明確表示：愿意跟大家一起，共同努力，將《中國生化藥物雜志》辦好，力爭將其辦成領域內的、未來在國際上有一定影響力的雜志。與會編委亦紛紛表示，要積極參與編輯部的審稿和組稿工作，盡心盡力為雜志的發展貢獻力量。

In vitro study of inhibitory effect of Ulinastatin against serine protease activity

CHEN Jian-wen, ZHANG Ren-wei, WEN Wei-jie, LI Si-tong, Liu Cui, LIU Pei-qing, LI MinΔ

(Center for Drug Screening, School of pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo study inhibitory effect of serine protease activity by Ulinastatin in vitro.MethodsDifferent chromogenic peptides were designed and synthesized.Highly sensitive fluorescence detection was performed to optimize the concentration of each serine proteases and their chromogenic substrates.Multi-point method was used for the calculation of half maximal inhibitory concentration of Ulinastatin.ResultsUlinastain could inhibit Polymorphonuclear leukocyte elastase (PMNE) and plasmin with IC50 lower than 100 U/mL.For factor Xa, and Kallikrein, the IC50 of Ulinastatin was higher than 1000U/mL.No thrombin IC50 could be calculated at the present experiments.ConclusionSimilar to Ulinastatin injection from Japan, domestic Ulinastatin shows the strongest inhibitory effects on PMNE among those serine proteases.As important references, this study gives reliable data for dose range of domestic Ulinastatin in anti-inflammation, coagulation/anti-coagulation and anti-shock therapy.

Ulinastatin; anti-coagulant; serine protease; fluorescence detection

陳健文，男，碩士，主管技師，研究方向：藥理毒理與藥效評價，E-mail: 573016880@qq.com；通訊作者，李民，男，博士、副教授，研究方向：藥物篩選與藥物評價，E-mail:limin65@mail.sysu.edu.cn。

R965

A

1005-1678(2015)08-0015-04