大黃素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌作用機制研究

畢月，隋佳琪，喬瑞紅，謝明杰

(遼寧師范大學 生命科學學院 遼寧省生物技術與分子藥物研發重點實驗室，遼寧 大連 116081)

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大黃素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌作用機制研究

畢月，隋佳琪，喬瑞紅，謝明杰Δ

(遼寧師范大學 生命科學學院 遼寧省生物技術與分子藥物研發重點實驗室，遼寧 大連 116081)

目的 研究大黃素對MRSA41577菌株細胞膜、蛋白質和核酸的影響，探討其對MRSA的抑菌作用機制。方法 采用TTC法測定大黃素對MRSA41577的抑制作用；檢測細胞電導率和大分子含量確定大黃素對MRSA41577細胞膜的影響；SDS-PAGE檢測大黃素對MRSA41577可溶性蛋白的影響；DAPI染色法測定大黃素對MRSA41577核酸含量的影響；紫外吸收光譜分析法檢測大黃素與DNA的相互作用方式。結果 大黃素對MRSA41577菌株具有顯著的抑制作用，其最低抑菌濃度為8 μg/mL。8 μg/mL的大黃素作用菌體6h，與對照組相比，細胞大分子和電導率分別增加了(71.48±0.026)%(P<0.01)和(2.39±0.102)%(P<0.05)。8 μg/mL的大黃素作用菌體16 h，菌體可溶性蛋白的含量與對照組相比降低了32.8%(P<0.01)，DNA和RNA含量分別降低了(4.82±1.06)%(P<0.05)和(6.67±0.36)%(P<0.05)。紫外吸收光譜結果顯示，大黃素可與DNA發生結合，其結合方式為氫鍵結合。結論 大黃素對MRSA的抑制作用機制主要是破壞菌體細胞膜，通過氫鍵結合干擾DNA的復制和轉錄，進而抑制蛋白質的合成，從而破壞菌體的生物學功能。

大黃素；MRSA；抑菌；機制

抗生素的濫用使得耐藥菌株大量出現，其中以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin Staphyloccocusn aureus，MRSA)在臨床上最為普遍，有“超級細菌“之稱。MRSA可在人源和動物源細菌間傳播，給臨床治療帶來極大的麻煩[1]，因此尋找高效、無毒、不易產生耐藥性的抑制MRSA的藥物成為當前研究的熱點。目前從中藥中篩選抗MRSA的藥物是主要的來源之一。大黃素是中藥大黃的有效單體，主要來源于蓼科植物掌葉大黃、虎杖的根莖和根中。近年來的研究結果顯示，大黃素具有廣泛的生物學活性，包括抗腫瘤作用、免疫調節作用、抑菌、促進腸道蠕動等活性[2]。本實驗室之前的研究結果顯示，大黃素能抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖，具有抗凋亡作用，且對機體的免疫系統有明顯的促進作用[3]。已有的研究結果顯示，大黃素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌等都具有較好的抑制作用[4-6]。但目前關于大黃素對MRSA的抑制作用研究較少，因此本文通過測定大黃素對MRSA41577菌株的細胞膜、蛋白質和核酸的影響，來闡述大黃素抑制MRSA的作用機制，旨在為開發抗MRSA藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株MRSA41577：由吉林醫大二院實驗室提供。

1.1.2 主要實驗試劑 LB液體培養基、DAPI染料購于上海生工生物工程有限公司。大黃素(純度≥98%)，購于成都曼斯特生物科技有限公司。pBR322購自寶生物(大連)有限公司。

1.1.3 主要儀器DDS-307A(DDB-600)型電導率儀；UV-1102紫外/可見分光光度計；電泳凝膠定量分析系統(TRANSILLUMZNATOR 2020D)；Cary Eclipse熒光分光光度計等。

1.2 方法

1.2.1 大黃素對MRSA最小抑菌濃度(MIC)的測定：取96孔板，分別加入90 μL MRSA菌懸液(107個/mL)和10 μL濃度為10、20、40、80、160、320 μg/mL的大黃素(終濃度分別為1、2、4、8、16、32 μg/mL)，每個濃度設3個復孔，另以大黃素的助溶劑無水乙醇為對照。于37 ℃ 120 r/min搖床中培養24 h，之后每孔加入20 μL 0.2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，再在37 ℃ 120 r/min避光培養4 h，觀察96孔板中液體顏色變化情況?；罹鷶盗吭蕉?，則液體紅色越深。

1.2.2 大黃素對MRSA大分子和電導率的影響：將培養至對數期的MRSA菌懸液(107個/mL)按2%的接種量加到40 mL LB液體培養基中，加入32 μL濃度為10 mg/mL的大黃素，使其終濃度為8 μg/mL，以大黃素助溶劑無水乙醇為對照組，于37 ℃ 120 r/min搖床中培養。分別在培養0、2、4、6、8 h時取8 mL菌懸液，4500 r/min離心5 min，取上清液，直接用電導率儀測定各組電導率的變化情況。大分子含量測定：取12 mL MRSA二代菌懸液離心，去上清，用PBS洗2次，加入10 mL PBS制成菌懸液，分到2個培養瓶中，每瓶加入15 mL PBS，向其中一瓶加入16 μL濃度為10 mg/mL的大黃素，使其終濃度為8 μg/mL。以大黃素助溶劑無水乙醇為對照組，于37 ℃ 120 r/min搖床中培養。取培養至0、2、4、6、8h的菌懸液3 mL，4500 r/min離心5 min，取上清，UV-1102紫外/可見分光光度計直接測定大分子的變化情況。試驗重復3次，取平均值。

1.2.3 大黃素對MRSA可溶性蛋白的影響：將培養至對數期的MRSA菌懸液(107個/mL)按2%的接種量加到20 mL LB液體培養基中，加入16 μL濃度為10 mg/mL的大黃素，使其終濃度為8 μg/mL，以大黃素助溶劑無水乙醇為對照組，于37 ℃ 120 r/min搖床中培養16 h。稱100 mg菌體，提取總蛋白，取40 μL蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，采用電泳凝膠系統蛋白分析軟件，定量分析各組菌體蛋白質的變化。

1.2.4 大黃素對MRSA中核酸含量的影響：取1.2 mL經8 μg/mL大黃素分別作用14、16、18、20 h的MRSA菌懸液，以加助溶劑無水乙醇為對照組(測定時調整對照組和實驗組的OD值一致)。加入3倍體積的DAPI染色液(CDAPI=0.8 μg/mL)。避光振蕩10 min，于DNA的激發波長364 nm和RNA的激發波長400 nm下，用Cary Eclipse熒光分光光度計分別測定菌體的DNA和RNA的熒光強度，實驗重復3次。

1.2.5 大黃素與DNA的相互作用：于pH 7.4的Tris-HCl緩沖液中加入1.5 μL濃度為10 mg/mL大黃素，使其終濃度為10 μg/mL，然后分別加入0、0.9、1.5、2.1 μL母液濃度為0.5 μg/ μL的pBR322使其終濃度分別為0、0.3、0.5、0.7 μg/mL，用pH7.4的Tris-HCl緩沖液將反應總體系補為1.5 mL。37 ℃水浴鍋中溫育30 min后，用紫外分光光度計測定A值。

2 結果

2.1 大黃素對MRSA41577的抑制作用 TTC的染色結果顯示，隨著大黃素濃度的增加，溶液顏色由紅逐漸變淺，表明大黃素對MRSA41577有一定的抑制作用，且呈濃度依賴性。當大黃素濃度>8 μg/mL時，溶液均變為無色，表明大黃素可完全抑制MRSA41577的生長，其MIC為8 μg/mL。見表1。

表1 大黃素對MRSA41577的抑制作用Tab.1 Inhibit effect of emodin on MRSA41577

“+++”為紅色，Red；“++”為粉紅色，Peach pink；“+”為粉色，Pink；“-”為無色，Colorless

2.2 大黃素對MRSA41577細胞膜的影響 電導率的改變可以反映藥物對細胞膜滲透性的影響[7]。實驗結果顯示，大黃素對培養液的電導率和大分子含量影響顯著，8 μg/mL的大黃素作用菌體6 h后，與對照組相比，大分子DNA和RNA含量從(0.249±0.021)增加到(0.427±0.019)，增加了(71.48±0.026)%(P<0.01，見圖1A)，電導率從(15.92±0.18)ms/cm增加到(16.3±0.11)ms/cm，增加了(2.39±0.102)%(P<0.05，見圖1B)。該結果表明，大黃素能破壞MRSA菌體細胞膜的結構，導致菌體內的無機離子和大分子的外流。

圖1 大黃素對MRSA41577大分子(A)和電導率(B)的影響(n=3)Fig.1 Effect of EM on macromolecules and conductivity against MRSA41577(n=3)

2.3 大黃素對MRSA41577可溶性蛋白的影響 蛋白分析軟件測定結果表明，8 μg/mL的大黃素作用供試菌株16 h后，菌體內可溶性蛋白的含量從160.51 ng降低到107.86 ng，降低了32.8%(P<0.01)，見圖2、圖3。表明大黃素能夠明顯抑制菌體可溶性蛋白的合成。

圖2 SDS-PAGE檢測大黃素對MRSA41577蛋白合成的影響Fig.2 Effect of EM on the soluble protein against MRSA41577 by SDS-PAGE

圖3 大黃素對MRSA41577蛋白含量的影響Fig.3 Effect of EM on the content of MRSA41577 protein

2.4 大黃素對MRSA41577核酸含量的影響 DAPI染色結果顯示，大黃素能夠降低菌體內DNA和RNA的含量，與對照組相比，8 μg/mL的大黃素作用菌體16 h后，DNA含量從(125.89±2.36)下降到(119.825±1.14)，降低了(4.82±1.06)%(P<0.05)。RNA含量從(30.268±0.624)下降到(28.248±0.31)，降低了(6.67±0.36)%(P<0.05)。見圖4。

圖4 大黃素對MRSA41577核酸含量的影響(n=3)Fig.4 Effect of EM on the synthesis of nucleic acid against MRSA41577(n=3)

2.5 大黃素與DNA的作用方式 紫外吸收光譜結果顯示，10 μg/mL大黃素與不同濃度的PBR322(終濃度分別為0、0.3、0.5、0.7 μg/mL)作用30 min，隨著DNA濃度的增加，大黃素的紫外吸收值逐漸增加，出現了明顯的增色效應，表明大黃素與DNA結合方式為氫鍵結合。見圖5。

圖5 大黃素對DNA吸收光譜的影響1～4：分別為0、0.3、0.5、0.7 μg/mL的pBR322Fig.5 Effect of EM on the absorption spectrometric titrations with DNADifferent concentrations (1～4：0、0.3、0.5、0.7 μg/mL) of PBR322

3 討論

MRSA是醫院感染的主要病原菌之一[8-9]，目前，臨床上使用的抗MRSA藥物仍然存在很大的局限性，因此獲得能抑制MRSA的藥物是解決臨床細菌感染的有效方法之一。Cao等[10]研究表明，虎杖根狀莖乙醚萃取物能夠顯著抑制MRSA的生長，而大黃素是虎杖根狀莖的主要成分，因此本文對大黃素抑制MRSA41577的作用及其機制進行了研究。TTC研究結果顯示，大黃素對MRSA41577具有顯著的抑制作用，其最小抑菌濃度為8 μg/mL。

細胞膜是保證細胞內環境穩定和細胞正常的代謝的屏障結構，細胞膜的破壞，會影響菌體的生命活動[11]。本實驗室前期研究結果表明，大黃素對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用，其抑菌作用機制主要是通過改變細胞膜的通透性，抑制菌體內的蛋白質合成，抑制代謝關鍵酶的活性[12]。為探究大黃素對MRSA 41577細胞膜的影響，測定了經大黃素作用后培養液中大分子和電導率的變化，研究結果顯示，8 μg/mL的大黃素作用菌體6 h后，電導率和大分子與對照組相比分別增加了(71.48±0.026)%和(2.39±0.102)%。說明大黃素可破壞MRSA的細胞膜的結構，導致菌體內無機離子和大分子外流，影響菌體正常的生理活動。蛋白質是細胞的物質基礎，是生命活動得以有效進行的重要保證，蛋白質合成受阻，會嚴重影響細胞的生理機能。本研究結果顯示，大黃素能顯著抑制MRSA41577的蛋白合成，其中8 μg/mL的大黃素作用菌體16 h后，與對照組相比，蛋白總量下降了32.8%。蛋白質的合成往往受核酸的調控，為進一步探究大黃素對MRSA 41577核酸合成的影響，本研究測定了大黃素對MRSA核酸合成的影響，DAPI染色結果顯示，大黃素能抑制MRSA核酸的合成，其中8 μg/mL的大黃素作用菌體16 h后，DNA和RNA含量分別降低了(4.82±1.06)%和(6.67±0.36)%。核苷酸是核酸發生改變的最低突變單位，組成核苷酸的磷酸基團和堿基是藥物分子識別的關鍵位點[13]。一般情況下，藥物與DNA的相互作用方式比較復雜，包括靜電作用，氫鍵結合，范德華力，離子鍵和疏水作用等，且這幾種作用可以同時存在并相互誘導和強化[14]。其中，化合物的紫外吸收光譜峰如果出現了紅移現象和減色效應，表明該化合物與DNA發生了嵌入結合，反之則表明該化合物與DNA發生的是靜電作用或溝槽作用。如果化合物的紫外吸收峰出現增色效應，表明化合物與DNA發生的是氫鍵結合[15-17]。本研究的紫外吸收光譜結果顯示，隨著質粒DNA濃度的增加，大黃素的紫外吸收值逐漸增加，出現了增色效應。說明大黃素能通過和DNA之間發生氫鍵結合，影響DNA進行正常的復制和轉錄，降低核酸的含量。

綜上所述，大黃素對MRSA的抑制作用機制主要是通過破壞細胞膜的完整性，與DNA發生氫鍵結合，干擾核酸的復制和轉錄，進而影響蛋白質的合成，致使菌體喪失其生物學功能。

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(編校：吳茜，譚玲)

Antibacterial mechanism of emodin on methicillin staphyloccocusn aureus

BI Yue, SUI Jia-qi, QIAO Rui-hong, XIE Ming-jieΔ

(College of Life Science, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery of Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo investigate effect of emodin on cell membrane, protein and nucleic acid synthesis of MRSA41577, and systematically investigate the anti-bacterial mechanism of emodin.MethodsTTC assay was used to detected the anti-bacterial activity of emodin on MRSA 41577.Conductivity and macromolecular were detected to investigate the effect of emodin on MRSA41577 cell membrane .SDS-PAGE was used to detect the effect of emodin on the soluble protein synthesis.DAPI staining was used to detect the effect of emodin on nucleic acid synthesis.UV-visible spectrophotometric was used to detected the interaction between emodin and DNA.ResultsEmodin has significant inhibitory activity on MRSA41577, and the minimum inhibitory concentration was 8 μg/mL.After treated with 8 μg/mL emodin for 6h, compared with control group, the macromolecular and conductivity improved (71.48±0.026)% (P<0.01) and (2.39±0.102)%(P<0.05), sepreatly.Compared with control, after treated with 8 μg/ml emodin for 16h，the protein reduced 32.8%, and the contents of DNA and RNA reduced (4.82 ±1.06)%(P<0.05,) and (6.67±0.36)%(P<0.053).The UV-visible spectrophotometric results indicated that emodin could integrate with DNA through hydrogen bond.ConclusionThe anti-bacterial mechanism of emodin mainly through damage the cell membrane, inhibit the replication and transcription of DNA through hydrogen bond, inhibit the synthesis of protein, and thus inhibit the biological function of bacteria.

emodin; MRSA; anti-bacterial; mechanism

遼寧省教育廳科學研究一般項目(No.L2013412);大連市科技計劃項目(No.2013E13SF108)

畢月，女，學士在讀，研究方向：生物科學，E-mail：1027510122@qq.com；謝明杰，通訊作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail：xmj1222@sina.com

R285.5

A

1005-1678(2015)08-0027-04