鴉蔥總黃酮抗乙型肝炎病毒的體外實驗研究

謝揚，王靜，耿艷梅，曲妍霏，張志，王廣樹

(吉林大學 藥學院，吉林 長春 130021)

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鴉蔥總黃酮抗乙型肝炎病毒的體外實驗研究

謝揚，王靜，耿艷梅，曲妍霏，張志，王廣樹Δ

(吉林大學 藥學院，吉林 長春 130021)

目的 探討鴉蔥總黃酮對乙型肝炎病毒的體外抑制作用。方法 通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)法觀察鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞的影響；采用酶聯免疫吸咐(ELISA)法檢測分析鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞分泌表面抗原(HBsAg)和E抗原(HBeAg)的抑制作用；采用熒光定量PCR法檢測鴉蔥總黃酮對乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)的影響。結果 鴉蔥總黃酮對 HepG2.2.15細胞的半數毒性濃度(TC50)為0.603 mg/mL；鴉蔥總黃酮高中低3個無毒劑量(0.062、0.125、0.250 mg/mL)均能明顯降低HepG2.2.15細胞培養液中HBsAg、HBeAg的含量和HBV-DNA數量，最大抑制率分別為89%、33%及43%。結論 鴉蔥總黃酮具有顯著的抗乙型肝炎病毒作用。

鴉蔥；黃酮；乙型肝炎病毒

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的一種嚴重危害人類健康及生命安全的常見重大疾病。其發病率高，病程長，自身免疫系統發生紊亂，部分患者最終發展為肝硬化、肝癌，且預后極差[1-3]。全世界有3.5～4.0億乙型肝炎病毒感染者[4]，其中，每年有近100萬患者死于HBV感染引起的肝硬化和肝癌[5-6]。在我國有1.2億多HBV感染者，約占全球感染總數的1/3，居世界首位，其中慢性乙型肝炎患者3000萬例，我國每年有近30萬患者死于因乙肝誘發的相關疾病[7-10]。乙肝給患者家庭、社會造成沉重的經濟負擔，引發一系列社會問題，是我國現階段最為突出的公共衛生問題之一。因此，尋找和研究既具有抗病毒又具有保肝作用的有效天然藥物，對慢性乙肝的治療具有十分重要的臨床意義。前期本研究課題組已證實了鴉蔥總黃酮的保肝作用[11]。本實驗旨在通過體外抑制HBV藥物篩選體系HepG2.2.15細胞，觀察鴉蔥總黃酮對細胞分泌HbsAg、 HbeAg和HBV DNA的影響，探討鴉蔥總黃酮的抗乙肝病毒作用，為鴉蔥總黃酮的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗原料：鴉蔥藥材采自于吉林省四平地區，經吉林大學藥學院生藥教研室張靜敏教授鑒定為鴉蔥ScorzoneraaustriacaWild。

1.1.2 細胞株：HepG2.2.15細胞株，復旦大學附屬腫瘤醫院提供。

1.1.3 主要藥品及試劑：D101型大孔樹脂、D4020型大孔樹脂(天津農藥股份有限公司樹脂分公司)；四季青胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)；高糖DMEM培養液(Gibco USA)；G418、MTT(Sigma公司)；雙抗(青鏈霉素，Hyclone公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；HBsAg ELISA檢測試劑盒、HbeAg ELISA檢測試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司)；乙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒(上海浩源生物科技有限公司)。

1.1.4 實驗儀器：TGL-16C離心機(上海安亭科學儀器廠)；DNM-9602酶標儀(北京普朗有限公司)；二氧化碳培養箱、無菌超凈臺(上海新苗醫療器械制造有限公司)；37XB倒置顯微鏡(上海光學儀器五廠)；ABI 7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；EZbead System-32核酸提取儀(Texas Biogene，Inc.)。

1. 2 方法

1.2.1 鴉蔥總黃酮(total flavonoids inScorzoneraaustriacaWild，TFSA)的制備[11]：鴉蔥全草，用70%的乙醇浸泡，減壓回收乙醇，然后上D-101大孔樹脂色譜柱，用水、60%的乙醇溶液洗脫，收集60%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，干燥，得鴉蔥粗制黃酮提取物。將粗制總黃酮上樣到D4020大孔樹脂色譜柱上，依次用水、5%乙醇、10%乙醇、30%乙醇洗脫，薄層色譜板檢測，收集含有黃酮部分的洗脫液，減壓濃縮，干燥，得到精制鴉蔥總黃酮。

1.2.2 鴉蔥總黃酮的細胞毒性實驗：用胰酶消化HepG2.2.15細胞，輕輕吹打分散成單個細胞懸液，用含10%胎牛血清的DMEM培養液配成細胞濃度為5×105個/mL的細胞懸液，按每孔0.1 mL分種于96孔板，置37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養箱內培養，待細胞長成單層后每孔加含不同濃度鴉蔥總黃酮培養維持液0.1 mL，每個濃度6孔。鴉蔥總黃酮實驗原液以含10%胎牛血清、380 μg/mL G418的DMEM培養液作系列倍比稀釋，配制成1.000、0.500、0.250、0.125、0.062 mg/mL 5個濃度鴉蔥總黃酮培養維持液。另設細胞對照組，每孔加0.1mL不含藥液的細胞培養液。將96孔板置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養箱內繼續培養，連續培養3d后，輕輕吸除培養細胞上清液，按Sargent JM等[12]建立的MTT法測定鴉蔥總黃酮對細胞生長的半數毒性濃度(TC50)：向前述細胞加入400 μg/mL MTT 0.1 mL/孔，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養箱內孵育4 h，再每孔加入100% DMSO 0.1 mL，37 ℃、5%CO2培養箱內密閉孵育約10 min后，用酶標儀在490 nm波長測定各孔OD值。TC50細胞破壞率(%)=(細胞對照組平均OD值-給藥實驗組平均OD值)/(細胞對照組平均OD值-空白對照組OD值)×100%。按照Reed-Meuench法[13]計算藥物的TC50=Antilog[B+(50%-<50%破壞率)/(>50%-<50%破壞率)×C]；A=log>50%藥物濃度，B=log<50%藥物濃度，C=A-B。

1.2.3 培養細胞上清液中HbsAg、HbeAg、HBV-DNA的檢測：按照1.2.2項下，將HepG2.2.15細胞接種于96孔板中，分為5個組，細胞對照組、低劑量鴉蔥總黃酮組(0.062 mg/mL)、中劑量鴉蔥總黃酮組(0.125 mg/mL)、高劑量鴉蔥總黃酮組(0.250 mg/mL)、拉米夫定陽性藥組(0.1 mg/mL)。每3 d更換一次培養液，同時收集各組3、6、9 d后培養板中細胞上清液。按照 ELISA試劑盒檢測說明書操作，酶標儀讀取各組OD450值，計算鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞上清液中HBsAg、HBeAg的抗原表達抑制率。按乙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒說明書操作，采用熒光定量PCR的方法檢測各組病毒數量，計算鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞培養液中3、6、9d的HBV-DNA病毒抑制率。

2 結果

2.1 鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞的毒性作用 MTT染色法結果顯示：在0.250 mg/mL及以下濃度下對HepG2.2.15細胞無毒性作用。鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞的TC50為0.603 mg/mL。見表1。

2.2 鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞上清培養液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的影響 ELISA結果顯示：0.250 mg/ mL鴉蔥總黃酮處理HepG2.2.15細胞9 d，對HBsAg的抑制率為89%，處理HepG2.2.15細胞bd對HBeAg的抑制率為33%。見表2、表3。熒光定量PCR結果顯示：0.125 mg/mL鴉蔥總黃酮處理HepG2.2H15細胞3 d對HBV-DNA的抑制率為43%。見表4。

表2 鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg的抑制作用Tab.2 Inhibitory effect of TFSA on HBsAg secreted by HepG2.2.15 ±s，n=6)

*P<0. 01，與對照組比較，compared with control group

表3 鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞分泌HBeAg的抑制作用Tab.3 Inhibitory effect of TFSA on HBeAg secreted by HepG2.2.15 ±s，n=6)

*P<0. 01，與對照組比較，compared with control group

表4 鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞分泌HBV-DNA的抑制作用Tab.4 Inhibitory effect of TFSA on HBV-DNA secreted by HepG2.2.15 ±s，n=6)

*P<0. 01，與對照組比較，compared with control group

3 討論

HepG2.2.15細胞株系以重組載體pDolTHBV-1(含2個HBV頭對尾二聚體，以尾對尾方向串聯)轉染人肝癌細胞株HepG2，經G418篩選后獲得的一個表達高水平HBsAg、HBeAg的細胞克隆[14]，由美國The Mount Sinai Medical Center 于1986年建立[16]，并且已成功地應用于抗HBV藥物的篩選[16-17]，作為抗HBV作用的指標，被中國衛生部收載于治療肝炎的《中藥新藥藥效學研究指南》[18]。乙型肝炎感染的血清標志物包括HBV DNA、HBsAg、HBeAg, 特別是HBV DNA水平的監測已成為抗HBV治療的評價標準[19]。因此，本實驗選用HepG2.2.15細胞作為細胞模型，以HBV DNA、HBsAg、HBeAg為指標，研究鴉蔥總黃酮的抗乙肝病毒作用。

本實驗首先通過MTT染色法，檢測鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞的毒性作用，結果發現TC50為0.603 mg/mL，在0.250 mg/mL及以下濃度下對HepG2.2.15細胞沒有毒性作用。然后在無毒濃度下進行藥物干預培養。利用HBsAg、HBeAg ELISA試劑盒，檢測鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg、HbeAg的抑制作用。結果表明，鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg、HBeAg有顯著的抑制作用(P<0.01)，且抑制率隨著鴉蔥總黃酮濃度的升高而增大，呈良好的劑量依賴關系。熒光定量PCR法結果表明，鴉蔥總黃酮對HepG2.2.15細胞上清培養液中HBV-DNA的含量有顯著降低體用(P<0.01)，其中0.125 mg/mL濃度的鴉蔥總黃酮干預細胞培養第3天后抑制率最大，達到43%，說明鴉蔥總黃酮具有抗乙肝病毒作用。因此鴉蔥總黃酮有望成為治療慢性乙型肝炎候選藥物。本研究為開發抗乙肝病毒藥物提供了實驗基礎。

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(編校：吳茜)

Experimental studies on inhibitory effects of total flavonoids inScorzoneraaustriacawild on hepatitis B virus in vitro

XIE Yang, WANG Jing, GENG Yan-mei, QU Yan-fei, ZHANG Zhi, WANG Guang-shuΔ

(School of Pharmaceutical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo investigate anti-HBV effect of total flavonoids inScorzoneraaustriacawild (TFSA) in vitro.MethodsMTT assay was used to observe the effect of TFSA on HepG2.2.15 cells，ELISA assay was used to detect the inhibition on HBsAg and HBeAg secretion from HepG2.2.15 cells and RTFQ-PCR assay was used to detect the inhibition rates of HBV-DNA.ResultsThe TC50of TFSA on HepG2.2.15 cells was 0.603 mg/mL. TFSA significantly reduced the content of HBsAg and HBeAg and the numbers of HBV-DNA in the HepG2.2.15 cell cultural supernatants under nontoxic concentrations (0.062, 0.125, 0.250 mg/mL), and the maximal inhibitory rate was 89%, 33% and 43%, respectively.ConclusionTFSA have anti-HBV effects in vitro.

Scorzoneraaustriacawild; flavonoids; hepatitis B virus

國家科技重大專項重大新藥創制(2013ZX09103002-007)

謝揚，女，碩士，研究方向：中草藥有效成分的研究，E-mail：13514486691@163.com；王廣樹，通訊作者，男，博士、教授、博士生導師，研究方向：中草藥有效成分的研究，E-mail：wgs@jlu.edu.cn。

R944.9

A

1005-1678(2015)08-0041-04