銀杏葉提取物對帕金森患者血清黑質DMT1、葡萄糖調節蛋白75及神經功能的影響研究

衛飛，帥杰，申林，龔自力，程賽宇

(第三軍醫大學第二附屬醫院 神經內科，重慶 400000)

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銀杏葉提取物對帕金森患者血清黑質DMT1、葡萄糖調節蛋白75及神經功能的影響研究

衛飛，帥杰，申林，龔自力，程賽宇

(第三軍醫大學第二附屬醫院 神經內科，重慶 400000)

目的 探討銀杏葉提取物對帕金森患者血清黑質二價金屬離子轉運蛋白(divalent metal transporter1，DMT1)、葡萄糖調節蛋白75(glucose regulated protein 75，grp75)及神經功能的影響。方法 帕金森患者38例，根據用藥不同分為對照組和實驗組，每組各19例，對照組患者給予多巴絲肼片，實驗組在對照組的基礎上給予銀杏葉提取物片，治療連續4周。治療結束后，對所有患者黑質DMT1、grp75及認知功能進行檢測。結果 與治療前相比，治療后2組患者的黑質DMT1水平較低(P<0.05)；與對照組相比，實驗組患者治療后黑質DMT1水平較低(P<0.05)。與治療前相比，治療后2組患者的grp75水平較高(P<0.05)，與對照組相比，實驗組患者治療后grp75水平較高(P<0.05)。與治療前相比，治療后2組患者的MoCA評分較高(P<0.05)，HAMD評分較低(P<0.05)；與對照組相比，實驗組患者治療后MoCA評分較高(P<0.05)，HAMD評分較低(P<0.05)。結論 銀杏葉提取物能夠顯著降低帕金森患者黑質DMT1水平，升高grp75水平，改善認知功能。

銀杏葉提取物；帕金森病；黑質DMT1；葡萄糖調節蛋白75；神經功能

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，是錐體外系功能紊亂引起的一種慢性中樞神經系統退行性疾病，多發于中老年人并嚴重影響其生活質量。目前該病的病因尚不明確，得到大多數學者公認的是多巴胺缺失學說[1]。美國約有100萬患者飽受震顫之苦，其中50萬人有帕金森病，我國發病人數約200萬，發病率高達l%以上[2]。除了運動功能障礙，大多數帕金森病患者都容易合并抑郁、情感淡漠、焦慮、認知功能障礙等非運動癥狀[3]。此外認知功能障礙、自主神經紊亂、精神異常等多種非運動癥狀是PD常見的并發癥[4]，約有2/5的患者會發展成癡呆，約為健康成人的6倍，嚴重影響患者的生存質量。臨床常用藥物有多巴胺，左旋多巴等，但其副作用較大，用藥不合理容易導致椎體外系綜合征。

銀杏葉為銀杏的干燥葉，在我國有悠久的藥用歷史，廣泛被藥學研究者研究、開發與利用。銀杏葉化學成分復雜，其發揮獨特藥理活性的主要有效成分為其所含的黃酮類、聚異戊烯醇類等化合物。研究顯示[5]，銀杏葉提取物EGb761具有多種生理活性，除對心血管系統具有明顯的保護作用外，在神經系統疾病治療中也有明顯療效，如改善腦和外周神經系統的血液供應，保護神經細胞免受損傷，改善神經退行性病變和衰老引起的認知能力的下降等作用。本研究通過觀察銀杏葉提取物對帕金森患者血清黑質DMT1、葡萄糖調節蛋白75及神經功能的影響，探究銀杏葉提取物對帕金森患者的療效，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院神經內科2014年1月～2015年3月收治的帕金森住院患者38例，隨機分為實驗組和對照組。其中實驗組19例，組內男性8例，女性11例，平均年齡(62.21±8.45)歲；對照組19例，男性10例，女性9例，平均年齡(63.35±8.39)歲。本試驗獲得我院倫理委員會批準，并且全程進行跟蹤隨訪監督。

所有患者均符合第五屆全國帕金森病和運動障礙疾病學術研討會2006[6]：帕金森病的診斷主要依靠病史、臨床癥狀及體征。根據隱襲起病、逐漸進展的特點，單側受累進而發展至對側，表現為靜止性震顫和行動遲緩，排除非典型帕金森病樣癥狀即可作出臨床診斷。對左旋多巴制劑治療有效則更加支持診斷。常規血、腦脊液檢查多無異常；頭CT、MRI也無特征性改變；嗅覺檢查多可發現PD患者存在嗅覺減退；以18F-多巴作為示蹤劑行多巴攝取功能PET顯像可顯示多巴胺遞質合成減少；以125I-β-CIT、99mTc-TRODAT-1作為示蹤劑行多巴胺轉運體(DAT)功能顯像可顯示DAT數量減少，在疾病早期甚至亞臨床期即可顯示降低，可支持診斷。

1.2 納入標準 所有入選患者均符合帕金森的診斷標準，經多巴胺類藥物治療有效，所有患者年齡在50～79歲之間，性別不限；患者意識清楚，能夠配合實驗措施。所有患者同意進行實驗措施，并簽署知情同意書。

1.3 排除標準 排除腦血管疾病、腦炎及外傷等原因引起的帕金森綜合征的患者；排除肝腎功能不全及心血管疾病的患者；排除高血壓及糖尿病患者；排除伴有認知功能嚴重障礙影響實驗進行的患者；排除不同意進行試驗措施的患者。

1.4 方法

1.4.1 治療方法：按照臨床用藥指南，2組患者均給予物理治療和功能鍛煉等基礎治療。對照組患者給予多巴絲肼片(上海羅氏制藥有限公司，國藥準字H10930198)，初始劑量62.5 mg，1次/天，5 d后，每次125 mg，2次/天，口服，此后為500 mg/d，3次/天，口服，一般在餐前或餐后1 h服用；實驗組在對照組的基礎上給予銀杏葉提取物片(Extract of Ginkgo Biloba Leaves Tablets，注冊證號：H20090296)，2片/次，3次/天，口服，治療連續4周。

1.4.2 患者黑質DMT1水平及葡萄糖調節蛋白75(glucose regulated protein 75，grp75)水平檢測：治療前后取患者清晨空腹血10 mL，置于抗凝管中備用。采用雙抗體夾心法檢測患者黑質DMT1水平及葡萄糖調節蛋白75(grp75)水平。將患者血液分成2份，2000 r/min離心30 min，取上清。將上清分別置于免疫實驗微孔板中，再分次向微孔中加入黑質DMT1還原酶與葡萄糖調節蛋白75還原酶，加入辣根過氧化物酶(HRP)，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，最后加底物3'，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)顯色。顯色后，TMB在HRP酶的催化下發生連續的顏色轉化，最后變為黃色。由于顏色深淺與標本血清中的黑質DMT1水平及葡萄糖調節蛋白75(grp75)水平呈正比例關系，用M600全自動酶標儀(上海研卉生物科技有限公司)測定標本的吸光度(OD值)，最終可得出黑質DMT1及葡萄糖調節蛋白75(grp75)濃度。具體操作步驟參照試劑盒(上海寶曼生物科技有限公司)說明書進行。

1.4.3 患者認知功能評定：所有患者采用蒙特利爾認知評估量表(MoCA)[7]以及漢密爾頓抑郁量表(HAMD)[8]對神經功能進行檢測，蒙特利爾認知評估量表包括12道題，包括注意力、語言能力、延遲回憶、命名能力、抽象能力、定向力、空間與執行功能。總分為30分，得分越高表明認知功能越好。患者受教育年限≤12年者，測試結果加1分。26分以上為認知功能良好。漢密爾頓抑郁量表包括焦慮/軀體化、認知障礙、日夜變化、睡眠障礙等方面組成。結果判定標準：總分>35分為嚴重抑郁，21～35分之間為輕中度抑郁，8～20分之間為臨界抑郁，<8分為無抑郁。

2 結果

2.1 患者一般情況比較 實驗組與對照組患者在男女比例，年齡，病程以及受教育年限資料差異無統計學意義。見表1。

表1 2組患者一般情況表±s)Tab.1 Comparison of the baseline between two ±s)

2.2 治療前后2組患者黑質DMT1水平比較 與治療前相比，治療后2組患者的黑質DMT1水平較低(P<0.05)；與對照組相比，實驗組患者治療后黑質DMT1水平較低(P<0.05)。見表2。

表2 治療前后2組患者黑質DMT1水平比較Tab.2 Comparison of the DMTI levels between two ±s，μmol/L)

*P<0.05，與治療前相比，compared with pre-treatment；#P<0.05，與對照組治療后相比，compared with control group post-treatment

2.3 治療前后2組患者grp75水平比較 與治療前相比，治療后2組患者的grp75水平較高(P<0.05)，與對照組相比，實驗組患者治療后grp75水平較高(P<0.05)。見表3。

表3 治療前后2組患者grp75水平比較Tab.3 Comparison of the grp75 levels between two ±s，μmol/L)

*P<0.05，與治療前相比，compared with pre-treatment；#P<0.05，與對照組治療后相比，compared with control group post-treatment

2.4 治療前后2組患者認知功能比較 與治療前相比，治療后2組患者的MoCA評分較高(P<0.05)，HAMD評分較低(P<0.05)；與對照組相比，實驗組治療后MoCA評分較高(P<0.05)，HAMD評分較低(P<0.05)。見表4。

表4 治療前后2組患者認知功能評分比較±s，分)Tab.4 Comparison of the cognitive functions between two ±s，score)

*P<0.05，與治療前相比，compared with pre-treatment；#P<0.05，與對照組相比，compared with control group

3 討論

據資料顯示，我國有超過500萬的帕金森病患者，55歲以上的人群中帕金森患病率約為1%，隨著年齡的增長，帕金森的患病率也逐漸升高[9]。隨著世界人口老齡化日趨嚴重，帕金森綜合征的患病率也逐年升高。帕金森病主要表現除運動障礙之外，還伴有焦慮、抑郁、認知功能障礙、精神異常等多種非運動癥狀。其最主要的病理改變是中腦黑質多巴胺能神經元的變性死亡。

本研究表明，治療后2組患者的黑質DMT1水平均顯著下降(P<0.05)；治療后，與對照組相比，實驗組患者的黑質DMT1水平下降較為明顯(P<0.05)。研究顯示[10]，帕金森病是由于中腦黑質多巴胺能神經元的變性死亡與過渡金屬鐵的關系密切。帕金森病患者腦內鐵的含量顯著升高，升高的主要部位是黑質和蒼白球，其升高程度與帕金森病的嚴重程度相關。近年來，采用經顱超聲方法檢測到帕金森病患者黑質部回聲增強，這可能與該部位鐵含量的升高有關。鐵代謝有賴于各種相關蛋白的調節。帕金森病患者中，許多與鐵代謝有關的蛋白表達出現異常，如CP、DMT1等。DMT1是一種跨膜的鐵轉出蛋白。研究表明[11]，在帕金森患者黑質神經元細胞中，DMT1有中度高表達，并且與鐵升高的部位相同，表明其可能是導致鐵含量升高的原因。DMT1作為金屬離子轉運體，可能是腦內鐵離子紊亂的原因之一。本研究治療后DMT1水平顯著下降(P<0.05)，表明本實驗措施能夠通過減少腦內DMT1水平達到使腦內鐵含量下降的目的。

分子伴侶(molecular chaperones)是一類保守蛋白質，可識別肽鏈的非天然構象，能夠參與蛋白質的變構、轉運及降解，對蛋白質的正確折疊，保護新生蛋白質的伸展狀態具有促進作用。能夠保護細胞免受損傷。葡萄糖調節蛋白75是一種主要存在于細胞線粒體中的熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)。它行使分子伴侶的功能，協助細胞質中合成的線粒體蛋白肽鏈轉運入線粒體，幫助肽鏈在線粒體中正確折疊和裝配，介導異常蛋白質的降解[12]。本研究表明，治療后2組患者的grp75水平均顯著上升(P<0.05)，實驗組患者的grp75水平上升較明顯(P<0.05)。近年來的研究證實，grp75與帕金森病密切相關。帕金森病患者黑質線粒體中grp75的表達顯著降低，且帕金森病患者grp75的基因突變能夠顯著影響線粒體功能[13]。本實驗結果表明，銀杏葉提取物能夠顯著升高患者腦內grp75水平，對帕金森病具有較好的治療作用。

本研究通過探究銀杏葉提取物對帕金森患者黑質DMT1、grp75水平，認知功能的影響，證實了銀杏葉提取物能夠顯著降低帕金森患者黑質DMT1水平，升高grp75水平，改善認知功能。本實驗得出的結論及反映的現象將在下一步研究中深入論證。

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(編校：譚玲)

Effect of Ginkgo biloba extract on serum DMT1, grp75 and neurological function in patients with Parkinson disease

WEI Fei, SHUAI Jie, SHEN Lin, GONG Zi-li, CHENG Sai-yu

(Department of Neurology, The Second Affiliated Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of Ginkgo biloba extract on serum divalent metal transporter1(DMT1), glucose regulated protein 75(grp75) and nerve function in patients with Parkinson disease.Methods38 cases of patients loith parkinson disease according to different drugs were divided into experimental group and control group, 19 cases in each group.Control group was treated with levodopa and Benserazide tablet, experimental group on the basis of control group, was given Ginkgo biloba extract tablets, treatment for 4 weeks. After treatment, DMT1, grp75 and cognitive function of all patients in substantia nigra were detected.ResultsCompared with before treatment, two groups of patients with lower DMT1 level (P<0.05), compared with control group, experimental group of patients with lower DMT1 levels (P<0.05). Compared with pre-treatment, two groups of patients grp75 level was higher (P<0.05), compared with control group, experimental group after treatment grp75 level was higher (P<0.05). Compared with before treatment, the two groups of patients with MoCA scores were higher (P<0.05), HAMD scores were lower (P<0.05).Compared with control group, experimental group after treatment MoCA scores were higher (P<0.05), HAMD scores were lower (P<0.05).ConclusionGinkgo biloba extract can significantly reduce the level of DMT1 in the substantia nigra of Parkinson patients, increase the level of grp75, and improve the cognitive function.

Ginkgo biloba extract; Parkinson disease; substantia nigra DMT1; glucose regulated protein 75; nerve function

衛飛，男，博士，主治醫師，研究方向：神經病學，E-mail：sdfghjk8kio@sina.com。

R741

A

1005-1678(2015)08-0072-03