正交試驗優選歸芪益氣養血合劑的水煎工藝

祁俊，朱應成，劉亮鏡，朱和平，潘揚

(1.安徽省蕪湖市中醫醫院 制劑室，安徽 蕪湖 241000；2.南京中醫藥大學 藥用菌與中藥生物技術研究所，江蘇 南京 210023)

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正交試驗優選歸芪益氣養血合劑的水煎工藝

祁俊1，朱應成1，劉亮鏡1，朱和平1，潘揚2Δ

(1.安徽省蕪湖市中醫醫院 制劑室，安徽 蕪湖 241000；2.南京中醫藥大學 藥用菌與中藥生物技術研究所，江蘇 南京 210023)

目的 建立測定歸芪益氣養血合劑中黃芪甲苷含量的超高效液相色譜-蒸發光散射(ultra-high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，UPLC-ELSD)法，以浸膏得率、黃芪甲苷和芍藥苷含量的綜合評分為指標優選制劑的最佳水煎工藝。方法 UPLC-ELSD法測定制劑中黃芪甲苷含量的條件如下，色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm× 50 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈-水(35:65)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；ELSD參數：漂移管溫度=60 ℃，霧化氣體(N2)流速=2.0 L/min。芍藥苷的含量測定采用前期研究建立的HPLC測定方法。以浸膏得率、黃芪甲苷和芍藥苷含量的綜合評分為指標，通過正交試驗考察加水量(A)、提取時間(B)、提取次數(C)對水煎工藝的影響。結果 UPLC-ELSD測定黃芪甲苷方法線性關系良好(r=0.9999)，平均加樣回收率為103.0%，并具有良好的精密度、專屬性和重現性。水煎工藝的正交試驗結果表明，影響提取效果的因素主次順序依次為：提取次數>加水量>提取時間，且方差分析表明提取次數對實驗結果影響顯著(P<0.05)。歸芪益氣養血合劑的最佳水煎工藝為：每次加水8倍量，水煎2次，總提取時間1.5 h。結論 優化的水煎工藝具有可操作性、穩定性好，適用于產業化生產。

歸芪益氣養血合劑；正交試驗；水煎工藝；黃芪甲苷；芍藥苷

歸芪益氣養血合劑來源于臨床經驗方，為中醫名方“補陽還五湯”加減變化而來，由黃芪、當歸、赤芍、川芎、甘草、桑寄生等藥味組成，具有補氣活血、養血通絡的功效，安徽省蕪湖市中醫醫院長期以來用于氣虛血瘀型中風恢復期及后遺癥期的康復及治療，發現其較單純使用西藥療效更好，且在治療過程中未發現不良反應[1]。中藥合劑是在湯劑的基礎上改進和發展起來的中藥劑型，其最大限度地保留了傳統湯劑吸收快、奏效迅速的優勢；且可大量生產，免去臨用煎藥的麻煩，應用方便。中藥合劑的工藝流程一般為：浸提→凈化→濃縮→分裝→滅菌等，其中浸提操作一般按湯劑的水煎方法進行，是合劑制備工藝中最關鍵的生產步驟[2]。本實驗首次采用超高效液相色譜-蒸發光散射(ultra-high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，UPLC-ELSD)法測定歸芪益氣養血合劑中黃芪甲苷的含量；并以芍藥苷、黃芪甲苷含量和浸膏得率的綜合評分為指標，通過正交試驗考察加水量、提取時間、提取次數對水煎工藝的影響，確定歸芪益氣養血合劑的最佳水煎工藝。

1 材料與方法

1.1 材料 高效液相色譜儀(Acquity UPLC-ELSD，美國Waters公司)；AL-204型萬分之一電子天平，XP-205型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。歸芪益氣養血處方為黃芪、當歸、赤芍、川芎、地龍、雞血藤、紅花、甘草、桑寄生、牛膝、鹽杜仲、續斷，藥材均由安徽井泉集團中藥飲片有限公司提供，經蕪湖市中醫醫院藥劑科主任徐斌副主任中藥師鑒定，均符合2010年版《中國藥典》一部相關項下要求；其中，黃芪、當歸分別為豆科植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)和傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，其中黃芪為蜜制品。芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110736-201337，經HPLC歸一化法測定其純度94.9%)；黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110781-201314，經HPLC歸一化法測定其純度95.8%。乙腈(色譜級，美國TEDIA公司)；HPLC用水為“娃哈哈”純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 水煎提?。喊礆w芪益氣養血方處方量稱取黃芪、赤芍及其它各味藥材共800 g，加水煎煮，6層紗布濾過，合并濾液，濃縮并加蒸餾水至1 000 mL(每mL含生藥量0.8 g)，作為供試品母液。

1.2.2 黃芪甲苷的含量測定：黃芪甲苷作為歸芪益氣養血方中君藥黃芪的活性成分，是其質量控制的主要指標，具有調節機體免疫力、保護組織器官、降低血糖、抗細胞凋亡和抗炎抗病毒等多方面的藥理作用[3]。有關黃芪甲苷含量測定的方法很多，目前常用的主要是液相色譜的方法，有HPLC-ELSD(蒸發光散射檢測器)[4]、HPLC-UV(紫外可見光檢測器)[5]、HPLC-RI(示差檢測器)[6]和HPLC-MS[7]等方法。其中，HPLC-MS雖然有較高的準確性和靈敏度，但使用儀器昂貴，操作復雜，故不適合常規質量分析。目前UPLC-ELSD[8-9]法是較為常用的黃芪甲苷的測定方法。UPLC是以1.7 μm的超細色譜柱填料為核心技術的新型色譜分離分析技術，相對于中藥常規HPLC而言，UPLC有更好的分離效率及靈敏度[10]。參考黃芪甲苷的《中國藥典》[11]及文獻[8-9]UPLC-ELSD含量測定，本研究對流動相加以改進，首次建立了適合歸芪益氣養血合劑中黃芪甲苷含量測定的UPLC-ELSD法。

① 色譜條件：Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜儀，包括四元梯泵、自動進樣器、柱溫箱、蒸發光散射檢測器(ELSD)以及Empower 3色譜工作站(美國Waters公司)；色譜柱：Waters Acquity BEH C18(2.1 mm× 50 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈-水(35:65)，流速：0.3 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：30 ℃。理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于4000；

② ELSD參數的選擇：霧化氣體流速和漂移管溫度是影響蒸發光散射檢測器響應的2個基本參數，實驗過程中對這2個參數進行了選擇，同時對比了分流和不分流2種模式；

霧化氣流速對響應靈敏度有影響。實驗考察了1.0、2.0和3.0 L/min 3個流速水平，發現在固定漂移管溫度和分流模式前提下，噪聲響應隨霧化氣流速變小而變大；但當霧化氣流速增大到一定程度時，待測成分響應信號又有較大程度降低。經過對比優化，最后確定采用2.0 L/min的霧化氣體流速；

漂移管溫度在本實驗中會較大程度的影響檢測信號響應。實驗考察了50 ℃、60 ℃、70 ℃ 3個溫度水平的檢出限(S/N=3為基準)。結果表明，檢出限在60 ℃溫度下最低，可能是由于50 ℃溫度下溶劑揮發不完全會造成較大的背景噪聲，而溫度70 ℃時待測成分又部分揮發而使有效響應信號降低，因此最終確定采用60 ℃的漂移管溫度。

對比分流和不分流2種模式，發現在分流情況下檢測靈敏度較低，最后確定使用不分流模式。

最終確定的ELSD參數：漂移管溫度：60 ℃，霧化氣體(N2)流速：2 L/min；

③ 對照品溶液的制備：精密稱取黃芪甲苷對照品18 mg(精確至0.00 mg)，置50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為360 μg/mL的對照品貯備液，備用。精密吸取對照品貯備液1 mL至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得濃度為72 μg/mL的對照品溶液；

④ 供試品溶液的制備：精密量取“1.2.1”項下供試品母液25 mL，分別置于分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取4次(50 mL/次)，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次(50 mL/次)，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得供試品溶液；

⑤ 專屬性試驗：根據處方稱取除黃芪外的其他幾味藥材，按“1.2.1”項下方法制成不含黃芪的空白對照樣品，再按“1.2.2④”項下方法制成空白對照溶液。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液，按“1.2.2①”項下色譜條件注入超高效液相色譜儀，記錄UPLC色譜圖；

⑥ 線性關系的考察：分別精密吸取黃芪甲苷(360 μg/mL)對照品貯備液0.5、1、2、3、4、5 mL，置于5 mL容量瓶中，加(或不加)甲醇至刻度，搖勻，制得濃度分別為36、72、144、216、288、360 μg/mL的對照品溶液，按“1.2.2①”項下色譜條件分別進樣2 μL，測定其峰面積。以對照品溶液濃度(μg/mL)的常用對數為橫坐標X，以黃芪甲苷峰面積(A)的常用對數為縱坐標Y，繪制曲線；

⑦ 精密度試驗：精密吸取“1.2.2③”項下對照品溶液2 μL，按“1.2.2①”項下色譜條件連續進樣6次，測定黃芪甲苷峰面積值；

⑧ 日內精密度試驗：精密吸取“1.2.2③”項下對照品溶液2 μL，按“1.2.2①”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10 h進樣1次，測定黃芪甲苷峰面積值；

⑨ 重復性試驗：平行稱取“1.2.1”項下浸膏適量(含生藥量10 g)6份，分別按“1.2.2④”項下方法制備供試品溶液，并按“1.2.2①”項下色譜條件進行測定并計算；

⑩ 加樣回收率試驗：精密量取“1.2.1”項下供試品母液12.5 mL，平行6份，分別精密加入360 μg/mL的黃芪甲苷對照品溶液1.8 mL× 2，2.4 mL× 2以及3.0 mL× 2，加蒸餾水稀釋至25 mL，按“1.2.2④”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.2①”項下色譜條件進行測定，并計算加樣回收率；

1.2.3 芍藥苷的含量測定：按照前期研究建立的歸芪益氣養血合劑中芍藥苷含量的HPLC測定方法[12]。

① 芍藥苷色譜條件：高效液相色譜儀同“1.2.2①”項下；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm× 150 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸(14:86)，流速：1 mL/min；進樣量10 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：230 nm。理論板數按芍藥苷峰計算應不低于2000；

② 對照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷對照品10.1 mg(精確至0.00 mg)，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為202 μg/mL的芍藥苷對照品貯備液。精密吸取芍藥苷對照品貯備液2 mL至5 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，制得濃度為80.8 μg/mL的芍藥苷對照品溶液；

③ 供試品溶液的制備：精密量取“1.2.1”項下供試品母液5 mL至50 mL容量瓶，加水稀釋并定容至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得供試品溶液。

1.2.4 正交試驗因素及水平設計：影響中藥合劑浸提工藝的主要因素包括加水量(A)、提取時間(B)和提取次數(C)，在單因素試驗的基礎上，以上每個因素設定成3個水平，因素和水平見表1，其中B和C的相關性設計見表2。由于中藥成分復雜，為避免單一指標進行工藝優化時產生偏差，保持本方的特點，最大程度發揮中藥制劑的復方功效，多指標有效控制該制劑的質量，以浸膏得率、黃芪甲苷和芍藥苷的含量的綜合評分為指標，采用L9(34)正交試驗設計[13]優選歸芪益氣養血合劑的水煎工藝。

表1 歸芪益氣養血合劑水煎工藝的因素和水平

表2 水煎工藝提取時間和提取次數的分配關系

1.2.5 測定結果的計算與分析：① 浸膏得率的測定：精密量取“1.2.1”項下供試品母液25 mL，平行3份，置于干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后于105 ℃干燥3 h，干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質量(精確至0.0000 g)。

浸膏得率(%)=浸膏得量(g)/[25( mL)× 0.8(g/ mL)]×100；

② 加權綜合評分的獲得：采用綜合評分加權法對歸芪益氣養血合劑的水煎工藝進行評價，根據各指標成分在工藝選擇中的主次地位給予不同的加權系數，其中黃芪甲苷、芍藥苷為本制劑主要的有效成分指標，權重系數均為0.4；浸膏得率是飲片的溶出行為指標，權重系數為0.2，綜合評分為3者分別權重積分之和。

黃芪甲苷相對含量(%)=各實驗黃芪甲苷含量/最高含量×100；

芍藥苷相對含量(%)=各實驗芍藥苷含量/最高含量×100；

相對浸膏得率(%)=各實驗浸膏得率/最高得率×100；

綜合評分(%)=(黃芪甲苷相對含量×0.4+芍藥苷相對含量×0.4+相對浸膏得率×0.2)

1.2.6 驗證試驗：按歸芪益氣養血方處方量放大100倍生產，稱取黃芪、赤芍及其它各味藥材共80 kg，平行3份，按上述確定的最佳水煎工藝條件進行提取、驗證。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件進行實驗數據分析，綜合評分結果采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪甲苷含量的UPLC-ELSD檢測考察結果

2.1.1 專屬性試驗結果：由圖1可知，在此色譜條件下，供試品溶液中黃芪甲苷色譜峰與黃芪甲苷對照品色譜峰保留時間一致，并與其他共存化學成分分離度大于1.5，基本達到基線分離；且空白對照溶液在相應的位置無色譜峰干擾。

圖1 專屬性試驗超高效液相色譜圖A：對照品溶液；B：供試品溶液；C：空白對照溶液；1：黃芪甲苷峰Fig.1 UPLC chromatograms of specificity testA: sample solution; B: standard solution; C: blank; 1：astragaloside peak

2.1.2 線性關系的考察結果：以對照品溶液濃度(μg/mL)的常用對數為橫坐標X，以黃芪甲苷峰面積(A)的常用對數為縱坐標Y，得對數方程為Y=1.7497X+0.2278，r=0.9999。該結果表明，黃芪甲苷在36～360 μg/mL的濃度范圍內，與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.3 精密度試驗結果：連續測定所得黃芪甲苷峰面積的RSD為1.9%(n=6)，提示該測定方法精密度良好。

2.1.4 日內精密度試驗結果： 10 h內所得黃芪甲苷的RSD為4.3%，提示在10 h內供試品基本穩定。

2.1.5 重復性試驗結果：黃芪甲苷的平均含量為68.3 μg/mL，RSD為2.1%，提示該方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗結果：黃芪甲苷平均加樣回收率為103.0%，RSD為3.0%。

2.2 正交試驗測定結果 由表3的正交試驗直觀分析結果可見，歸芪益氣養血合劑的最佳水煎工藝條件為：A2B2C2，即每次加水8倍量，煎煮2次，煎煮時間為1.5 h。由表4綜合評分的方差分析可以看出，影響綜合評分因素的排序為：C>A>B。較主要的因素是C，其次是A和B。其中，A、B因素相對誤差(D)而言，對水煎工藝并無顯著性影響；C因素對試驗結果則有顯著性影響。

表3 歸芪益氣養血合劑水煎工藝正交試驗分析

表4 綜合評分的方差分析

2.3 驗證試驗結果 水提取液(含生藥0.8 g/mL)中黃芪甲苷、芍藥苷的平均含量分別為71.4、720.6 μg/mL，RSD分別為1.7%、1.9%；浸膏得率平均為19.6%，RSD為1.2%；綜合評分97.3分，接近于滿分。提示優化的水煎工藝具有可操作性、穩定性好，適用于產業化生產。

3 討論

首次建立了適合歸芪益氣養血合劑中黃芪甲苷含量測定的高效、快速的UPLC-ELSD方法，其譜峰的保留時間全部在3 min內，極大地縮短分析時間，提高分析效率及色譜峰分離度，減少溶劑損耗及廢液處置費用，為高效、快速地監控歸芪益氣養血合劑質量提供了方法。

黃芪甲苷屬于無紫外吸收或僅存在紫外末端吸收的物質，不能采用UV檢測器檢測。所以，在沒有大大損失檢測靈敏度、可以滿足定性和定量要求的基礎上，選用中等靈敏度的通用型檢測器ELSD分析復雜中藥復方體系，是一種很好的替代方式。ELSD不受成分是否有紫外吸收或紫外吸收值差異的影響，且受共存物質干擾少，基線平穩。

中藥制劑的療效是多種活性成分共同作用的結果，僅對其中的一個或幾個成分加以控制，難以全面把握制劑的質量、療效和穩定性。本試驗采用正交試驗法，以黃芪甲苷、芍藥苷和浸膏得率等多指標綜合評定，對歸芪益氣養血合劑的水煎提取工藝進行了優選，確定最佳工藝參數，即每次加水量為8倍，煎煮2次，煎煮時間為1.5 h，并進行了放大驗證試驗，進一步說明優化的水煎工藝具有可操作性、穩定性好，適用于產業化生產。

中藥復方制劑水煎工藝考察除了應該對多種理化指標的綜合提取效果進行評價外，必要時還要結合藥理藥效學評價，才能充分保證水煎工藝的可靠性和臨床藥效。

本制劑的藥材在進行水煎煮提取前應浸泡約2 h，使其吸水完全，組織浸潤疏松，有利于有效成分的溶出，否則，藥材中的淀粉、蛋白質等受熱凝固，阻礙有效成分的溶出。

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(編校：王儼儼)

Optimization of water decoction process for Guiqi Yiqi Yangxue Mixture by orthogonal test

QI Jun1, ZHU Ying-cheng1, LIU Liang-jing1, ZHU He-ping1, PAN Yang2Δ

(1.Department of Pharmaceutical Preparation, Wuhu Hospital of Traditional Chinese Medicine, Wuhu 241000, China; 2.Medical Fungi and PhytoBiotech Laboratory in Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

ObjectiveTo establish ultra-high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector (UPLC-ELSD) method to determine the content of astragaloside in Guiqi Yiqi Yangxue Mixture and optimize the best water decoction process of the mixture.MethodsThe UPLC-ELSD conditions to determine the content of astragaloside in the mixture were as follow.The method was carried out on a Waters Acquity UPLC BEH C18column (2.1 mm× 50 mm,1.7 μm) by using acetonitrile-water (35:65) as mobile phase, and the flow rate was 0.3 mL/min and the column temperature 30 ℃.The parameter of ELSD: the drift tube temperature was set at 60 ℃, and the gas flow rate of N22.0 L/min.The content of paeoniflorin in the mixture was detected by previously established HPLC method.The orthogonal test was designed to optimize the water decoction process of the amount of water (A), decoction time (B) and decoction times (C), and the extract yield and the contents of astragaloside and paeoniflorin were evaluated as the comprehensive markers for the purpose.ResultsThe UPLC-ELSD determination of astragaloside had a good linear relationship (r=0.9999), its mean recovery was 103.0%, and it had a good precision, specificity and repeatability.The orthogonal experimental results showed that decoction times (C)>the amount of water (A)> decoction time (B) were major factors affecting the decoction process in order and the ANOVA result showed that decoction times has significant effect on the decoction process(P<0.05).The optimal process of Guiqi Yiqi Yangxue Mixture was adding eight-fold water each time to decoct twice for 1.5 h totally.ConclusionThis optimized water decoction process is feasible and stable, and suitable for industrialized production.

Guiqi Yiqi Yangxue Mixture; orthogonal test; water decoction process; astragaloside; paeoniflorin

安徽省省級中醫發展專項——特色中藥制劑研發項目(20110629)

祁俊，男，本科，副主任中藥師，研究方向：中藥制劑及質量標準研究，E-mail：whszyyyzyc@163.com；潘揚，通信作者，男，博士、研究員，研究方向：中藥化學與生物技術研究，E-mail：y.pan2006@163.com。

R283.5

A

1005-1678(2015)10-0151-05