原兒茶酸對帕金森模型大鼠血清TNF-α、IL-1β及氧化應激產物水平的影響

張強，劉友，張中海

(徐州醫學院 基礎醫學院遺傳學教研室，江蘇 徐州 221004)

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原兒茶酸對帕金森模型大鼠血清TNF-α、IL-1β及氧化應激產物水平的影響

張強Δ，劉友，張中海

(徐州醫學院 基礎醫學院遺傳學教研室，江蘇 徐州 221004)

目的 探討原兒茶酸對帕金森模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)及氧化應激產物水平的影響。方法 選取雄性SD大鼠60只，隨機分為正常對照組(n=10)、模型組(n=10)、美多芭組(n=20)和原兒茶酸組(n=20)。模型組、美多芭組和原兒茶酸組建立帕金森大鼠模型，美多芭組和原兒茶酸組大鼠分別給予相應藥物治療，持續2周。治療結束后，對所有大鼠的血清TNF-α、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及IL-1β水平進行檢測。結果 與正常對照組比較，模型組血清TNF-α、IL-1β、MDA水平明顯升高，而SOD水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，經治療后美多芭組和原兒茶酸組血清TNF-α、IL-1β、MDA水平明顯降低，而SOD水平明顯升高(P<0.05)。美多芭組與原兒茶酸組血清TNF-α、IL-1β、MDA及SOD比較差異無統計學意義。結論 原兒茶酸能夠明顯降低帕金森模型大鼠血清TNF-α、MDA及IL-1β水平，提高SOD活性，對帕金森病引起的氧化應激損傷有保護作用。

原兒茶酸；帕金森病；大鼠；腫瘤壞死因子-α；白介素1β；氧化應激

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又稱“震顫麻痹”、巴金森癥或柏金遜癥[1]，是常見的神經系統變性疾病，以中腦黑質多巴胺能神經元的變性死亡，引起紋狀體多巴胺含量下降為主要的病理改變。容易引起肢體靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、姿勢步態障礙等表現。PD好發于老年人，有資料稱，目前全世界有大約450萬PD患者[2]，而我國有220萬的PD患者，預計到2030年將達到500萬。我國>60歲人群PD的患病率為1%，>65歲人群PD的患病率為1.7%左右，并且有逐年上升的趨勢[3]，因此，積極控制病情發展尤為重要。PD為慢性進展性疾病，應用左旋多巴類藥物替代治療是目前最主要的治療手段。但是，左旋多巴制劑容易引起“開”“關”現象、療效下降、運動功能障礙等副作用[4]，臨床療效并不理想，所以，有效安全的藥物成為研究的熱點。原兒茶酸是一種天然的活性成分，具有抗菌、祛痰、改善心肌缺氧，近年來發現還具有抗氧化、促進腫瘤細胞凋亡等活性[5]，有研究顯示[6]，原兒茶酸能夠保護神經元免受氧化損傷，防止神經元凋亡。PD的發生也與氧化應激反應導致的神經元損傷有關，然而，目前關于原兒茶酸治療PD的相關研究較少。因此，本研究通過建立帕金森大鼠模型，并對治療后各組大鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、氧化應激產物及白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)水平進行檢測，來探討原兒茶酸對PD大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：選取SPF級成年雄性SD大鼠(由徐州醫學院實驗動物中心提供，動物許可證號: SYXK(蘇) 2005-0018)60只，體質量(210±20)g，周齡約6周。將所有大鼠置于鼠箱內分別進行適應性飼養1周，維持室溫在20 ℃～25 ℃，濕度約55%，給予充足的飲水和標準飼料，讓其自由活動與進食，設定晝夜周期為12 h。本實驗遵循《實驗動物保護條例》相關規定。

1.1.2 試劑：6-羥基多巴胺(6-OHDA，上海江萊生物科技有限公司)，水合氯醛(大連美侖生物技術有限公司)，阿樸嗎啡(上海浩然生物技術有限公司)，多巴絲肼片(上海羅氏制藥有限公司，國藥準字H10930198)；原兒茶酸(上海哈靈生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器：腦立體定位儀(51700系列，美國stoleting)；MB-602酶聯免疫分析儀(濟南普納儀器設備有限公司)；AU5400全自動生化分析儀(OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 造模及實驗方法：所有大鼠適應性飼養后，隨機分為正常對照組10只、模型組10只、美多芭組20只、原兒茶酸組20只。將6.7 mg 6-羥基多巴胺(6-OHDA)溶于1 mL含0.2%抗壞血酸的生理鹽水中，制成溶液(6.7 mg/mL)備用。對模型組、美多芭組和原兒茶酸組大鼠進行造模，采用腹腔注射10%的水合氯醛(40 mL/100 g)進行麻醉，麻醉成功后取仰臥位，將大鼠固定于腦立體定位儀上，定位左側紋狀體，鉆透顱骨，以1 μL/min的速度向左側紋狀體內注射6-OHDA溶液，留針10 min后緩慢拔針，常規縫合傷口、抗感染。手術2周后，用0.9%NaCl配制濃度為0.05 mg/mL的阿樸嗎啡溶液，經腹腔注射0.25 mg/kg，記錄大鼠的旋轉行為，速度達到6 r/min即為造模成功[7]，本研究各組大鼠均造模成功。用0.9%NaCl配制濃度為40 mg/mL的美多芭溶液，美多芭組大鼠灌胃400 mg/kg美多芭，每天1次灌胃治療；用0.9%NaCl配制濃度為0.5 mg/mL的美多芭溶液，原兒茶酸組皮下注射原兒茶酸5 mg/kg，每天1次。模型組予以等體積0.9%NaCl。2組大鼠均治療2周。

1.2.2 血清指標采集：治療結束后，分別采集各組大鼠的尾部靜脈血2 mL，然后分離血清，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中TNF-α、IL-1β水平，用酶標儀分析；采用硫代巴比妥酸比色法測定血清中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平及黃嘌呤氧化酶法測定血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，用全自動生化分析儀檢測。

2 結果

2.1 各組大鼠血清中TNF-α水平比較 模型組TNF-α水平明顯高于正常對照組(P<0.05)。治療后美多芭組和原兒茶酸組血清TNF-α水平明顯低于模型組(P<0.05)，但仍顯著高于正常對照組(P<0.05)。美多芭組和原兒茶酸組血清TNF-α水平差異無統計學意義。見表1。

表1 各組大鼠血清中TNF-α水平比較

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with mondel group

2.2 各組大鼠大鼠血清中IL-1β水平比較 模型組血清IL-1β水平明顯高于正常對照組(P<0.05)。治療后美多芭組和原兒茶酸組血清IL-1β水平明顯低于模型組(P<0.05)，且與正常對照組比較差異均無統計學意義。美多芭組和原兒茶酸組血清IL-1β水平差異無統計學意義。見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-1β水平比較

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with mondel group

2.3 各組大鼠大鼠血清中MDA、SOD水平比較 模型組血清MDA水平明顯高于正常對照組(P<0.05)，治療后美多芭組和原兒茶酸組MDA水平明顯低于模型組(P<0.05)，但仍顯著高于正常對照組(P<0.05)。模型組血清SOD水平明顯低于正常對照組(P<0.05)，治療后美多芭組和原兒茶酸組血清SOD水平明顯高于模型組(P<0.05)，且與正常對照組比較差異均無統計學意義。美多芭組和原兒茶酸組大鼠血清MDA、SOD水平差異無統計學意義。見表3。

表3 各組大鼠血清中MDA、SOD水平比較Tab.3 Comparison of serum MDA and SOD levels among each group (±s，mmol/L)

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with mondel group

3 討論

隨著社會老齡化的而不斷加深，作為一種退行性病變，PD患者的發病率不斷增加，威脅患者的生活質量和生命健康。PD的病因有年齡老化、遺傳、環境因素、腦外傷、感染和免疫、氧化反應異常等[8]，這些因素能夠導致位于大腦黑質的多巴胺能神經元損傷、凋亡，多巴胺合成分泌量減少，紋狀體、中腦-皮質系統、中腦-邊緣系統的多巴胺含量下降，引起運動功能障礙、智能、情感異常等相關臨床表現。原兒茶酸是3，4-二羥基苯甲酸，存在于益智仁、狗脊、桂枝、川芎等藥物中，具有多種生理活性[9]，不僅能夠抑制細菌、平喘、祛痰，還能夠抗血小板聚集、減少心肌耗氧、解毒，能夠通過組織線粒體膜電位的變化來減少活性氧產生，抑制氧化反應對細胞產生的損傷。已有研究顯示[10]，原兒茶酸對魚藤酮誘導的PD模型小鼠的腦組織具有保護作用。在本實驗中，通過對PD模型大鼠血清TNF-α、SOD、MDA及IL-1β等相關指標的檢測，觀察原兒茶酸對于PD的作用效果及機制。

本研究結果發現，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均明顯高于正常對照組，表明PD的發生與炎癥反應密切相關。TNF-α、IL-1β都是炎癥反應相關的重要細胞因子，TNF-α具有細胞毒性，在免疫應答和細胞凋亡過程中發揮重要作用；IL-1β在加重炎癥反應的同時，還能促進星形膠質細胞合成分泌一氧化氮，損害神經元。有研究報道[11]，炎癥反應機制可能參與對黑質多巴胺能神經元的損傷，這與TNF-α等細胞因子水平升高有關。本研究結果顯示，與模型組比較，美多芭組和原兒茶酸組大鼠的血清TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.05)，表明原兒茶酸能夠抑制PD患者體內的炎癥反應，減輕炎癥反應對于神經元的損傷。

氧化應激反應是帕金森病形成的主要原因之一，氧化反應能夠損傷神經元細胞，同時促進細胞凋亡。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清MDA水平明顯較高，血清SOD水平明顯較低(P<0.05)。MDA是脂質過氧化的產物，屬于不飽和脂肪酸，能夠促進脂質過氧化以及氧自由基的形成，加重氧化反應，影響細胞代謝，促進細胞凋亡，血清MDA水平常用來反映機體的氧化反應程度[12]；SOD是超氧化物歧化酶，能夠催化超氧化物陰離子自由基(O2-)還原，達到清除自由基，減輕氧化反應的作用，其血清水平常用來評價機體抗氧化能力[13]。MDA水平升高，SOD水平下降提示PD患者抗氧化能力減弱。而與模型組比較，美多芭組和原兒茶酸組大鼠的血清MDA水平明顯降低，血清SOD水平明顯升高(P<0.05)，表明原兒茶酸能夠提高機體抗氧化能力，減輕氧化損傷。

本實驗通過對60例PD模型大鼠血清TNF-α、SOD、MDA及IL-1β水平的檢測結果進行分析，證實了原兒茶酸能夠明顯降低帕金森模型大鼠血清TNF-α、MDA及IL-1β水平，提高SOD活性，對帕金森病引起的氧化應激損傷有保護作用。在下一步研究中，本課題組將進行分子機制方面研究，為本實驗所反映的現象做出進一步論證和分析。

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(編校：王儼儼)

Effect of protocatechuic acid on serum TNF-α, IL-1β and oxidative stress products levels in Parkinson rats

ZHANG QiangΔ, LIU You, ZHANG Zhong-hai

(Department of Medical Genetics,College of Basic Medicine，Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China)

ObjectiveTo explore the effect of protocatechuic acid on serum tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and oxidative stress products levels in Parkinson rats.Methods60 male SD rats were randomly divided into normal control group (n=10), model group (n=10), madopar group (n=20) and protocatechuic acid group (n=20). Rat model with Parkinson disease were builded in model group, madopar group and protocatechuic acid group. Madopar group and protocatechuic acid group were given corresponding drug with a consecutive treatment of two weeks. After treatment，the serum TNF-α,malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and IL-1β levels were detected in all groups.ResultsCompared with normal control group, the serum TNF-α, IL-1β and MDA levels in model group were significantly higher, and SOD level was lower (P<0.05). Compared with model group, the serum TNF-α, IL-1β and MDA levels in madopar group pre-treatment were significantly lower, and SOD level was higher (P<0.05). There were no significant difference of serum TNF-α, IL-1β, MDA and SOD levels between madopar group and protocatechuic acid group.ConclusionThe protocatechuic acid could significantly reduce the serum TNF-α, MDA and IL-1β levels in Parkinson model rats, enhance the activity of SOD, which has protective effect on oxidative stress injury induced by Parkinson disease.

protocatechuic acid; Parkinson disease; rat; tumor necrosis factor-α; interleukin-1β; oxidative stress

徐州醫學院優秀人才科研啟動基金(D2014004)

張強，男，博士，講師，研究方向：帕金森病，E-mail：drzhangqiangxz@163.com。

R742.5

A

1005-1678(2015)11-0037-03