siRNA抑制survivin基因表達對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖與凋亡的影響

馬莎，林俊Δ，晉松，李芹，張虹，于亮

(1.云南省第一人民醫院 風濕免疫科，云南 昆明 650032；2.中國醫學科學院 醫學生物學研究所遺傳室，云南 昆明 650118)

?

siRNA抑制survivin基因表達對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖與凋亡的影響

馬莎1，林俊1Δ，晉松1，李芹1，張虹1，于亮2

(1.云南省第一人民醫院 風濕免疫科，云南 昆明 650032；2.中國醫學科學院 醫學生物學研究所遺傳室，云南 昆明 650118)

目的 研究靶向存活素(survivin)的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制survivin基因表達對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASFs)增殖與凋亡的影響。方法 體外分離培養RA患者滑膜成纖維細胞(RASFs)，設計合成靶向survivin的siRNA及陰性對照，用脂質體法轉染RASFs細胞；實時定量聚合酶鏈反應和蛋白印跡法檢測RASFs中survivin的mRNA表達及蛋白水平。四甲基偶氮唑藍法檢測細胞增殖；TUNEL法檢測細胞凋亡。結果 實驗組與陰性對照siRNA組及空白對照組相比，轉染48h后滑膜成纖維細胞survivin的mRNA及蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。 實驗組與陰性對照siRNA組及空白對照組相比，轉染后的滑膜成纖維細胞增殖能力明顯下降(P<0.05)。實驗組轉染后24h、48h、72h生長抑制率分別為(11.5±2.6)%、(26.2±3.4)%、(47.6±4.1)%，于轉染后72小時最為顯著。實驗組凋亡率為(23.87±1.6)%，顯著高于陰性對照組(9.72±1.15)%和空白對照組(8.70±1.09) %(均P<0.05)。結論 靶向survivin的siRNA通過下調survivin表達水平，抑制滑膜成纖維細胞增殖并促進其凋亡。

存活素；類風濕關節炎；滑膜成纖維樣細胞； siRNA；凋亡

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關節滑膜組織炎性增生、新生血管形成及關節破壞為主要特征的慢性、進行性、自身免疫性疾病[1]。RA滑膜成纖維細胞(RA synovial fibroblasts，RASFs)是介導滑膜炎癥反應、血管翳形成和關節破壞的主要效應細胞[2]。

近年來，研究發現滑膜細胞凋亡障礙是RA發病的主要機制之一[3]。機體內存活素 (survivin)作為凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis of protein ，IAP)家族成員，不僅具有調控細胞凋亡細胞周期的雙重功能，而且可促進細胞轉化并且參與細胞的有絲分裂、血管的生成等[4]。已有研究表明，在類風濕性關節炎患者的滑膜組織，甚至成纖維樣滑膜細胞、滑液以及外周血中均發現有survivin異常高表達，且與關節侵蝕程度呈正相關[5-6]。Bokarewa等人發現血清中的survivn抗體能減緩這種侵襲過程，用survivin反義寡核苷酸下調survivin表達可以導致IL-6水平下降，從而減輕炎癥反應。深入認識和揭示survivin在RA滑膜凋亡異常及RA發病機制中的作用對尋找RA的基因靶向治療的方法具有重要意義。

本實驗旨在驗通過構建靶向survivin的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉染RASFs，觀察抑制survivin對RASFs增殖及凋亡的影響，為類風濕關節炎基因靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料：滑膜組織取材自云南省第一人民醫院風濕免疫科關節鏡下3例行部分切除膝關節滑膜手術的RA患者，其均符合2009年由美國風濕病學會修訂RA的診斷標準[7]，并排除其它自身免疫性疾病、感染、腫瘤等關節相關疾病。所有患者均簽署知情同意書。

主要試劑：澳洲胎牛血清FBS、DMEM高糖培養基、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、II型膠原酶(美國Sigma)，survivin兔抗人單克隆抗體(Abcam公司)，GAPDH鼠抗人單克隆抗體(上海abmart公司)，SYBR Green Master(Roch公司)，Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，小干擾RNA(siRNA)序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。實時熒光定量PCR引物(Invitrogen公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(北京全式金)，RI-PA裂解液、蛋白濃度測定試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒顯色法(碧云天生物技術公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養RA滑膜成纖維細胞：在無菌術室條件之下，關節鏡手術獲取RA患者的滑膜組織，一次性平皿中PBS沖洗組織4～5次，眼科剪充分剪碎至糊狀，加入約30倍體積的Ⅱ型膠原酶(1 mg/mL)于37 ℃含5%CO2細胞培養箱內消化4 h，每15 min取出振搖一次，對其進行1000 r/min離心，在5 min之后，去除其中膠原酶，并添加PBS液洗進行3次離心操作，并應用細胞篩除去組織中存在的碎塊，適量加入15%胎牛血清高糖DMEM培養液(含青鏈霉素雙抗)后，用巴氏細胞吸管反復吹打后轉移至細胞培養瓶放入培養箱，每過3 d后更換1次培養液，并除去其中未貼壁的細胞，2周之后，成纖維細胞貼壁生長密度可以達到85%～90%，并可按1:3比例設置，培養傳代細胞。對于本實驗中，將應用3～7代滑膜成纖維細胞。

1.2.2 siRNA轉染滑膜成纖維細胞：轉染前24 h選擇對數生長期RASFs細胞，按照4×105個/孔密度接種至6孔板，每孔使用2 mL不含抗生素10%FBS的高糖DMEM培養基培養，融合密度達80%時進行轉染，設空白對照組(加入DMEM高糖培養基)、陰性對照組(加入陰性對照序列siRNA)、實驗組(加入合成的survivin-siRNA)，按照轉染試劑Lipofectamine2000說明進行實驗。實驗組siRNA-survivin靶序列5’-GAAGCAGTT-TGAAGAATTA-3’NT391～409，陰性對照siRNA 5’-TTCTCCG-AACGTGTCACGT-3’。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測:可根據PCR檢測survivin mRNA的表達情況，收集轉染48 h后的細胞，依據Trizol方法提取轉染細胞中的總RNA，并應用紫外分光光度計檢測其純度和濃度。采用合格的RNA標本，每組總RNA各2 μg，按北京全式金cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA作為模板，采用SYBR熒光染料法進行實時定量PCR檢測各組mRNA表達，反應體系為25 μL，每個樣品分別設計3個重復。survivin上游引物：“5’-GACCACCGCATCTCTACATTC-3’ ”，下游引物：“5’-TGCTTTTTATGTTCCTCTATGGG-3’ ”；GAPDH上游引物為：“5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’ ”，下游的引物為：“5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’ ”；實時定量PCR儀循環設置：95 ℃10 min預變性，95 ℃ 15 s，58 ℃30 s，進行40個循環。用相對定量方法2-△△Ct值[8]表示目的基因mRNA的表達水平。

1.2.4 檢測survivin蛋白表達水平:轉染48h后收集細胞并提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。將定量后的蛋白(30 μg)用15%的十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離膠進行電泳分離，并轉移至聚偏二氟乙烯(poly vinylidenefluoride，PVDF)膜，然后用5%的脫脂奶粉進行封閉1 h，孵育survivin一抗(1:2000稀釋)、和內參GAPDH一抗(1:10000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，用特異性辣根過氧化物酶去標記二抗( 稀釋比例1:7000)，在室溫內孵育1 h，應用TBST3次洗膜，每次10 min。最后用化學發光試劑(chemiluminescence，ECL)顯色并于暗室曝光。標準化的數值由survivin目的條帶和GAPDH內參條帶的比值來確定。用Bio-Rad凝膠成像分析系統對電泳條帶進行密度掃描，用Scion-Image軟件對圖像進行分析，測目標蛋白和內對照GAPDH蛋白二者電泳條的灰度值，以其得出的比值來表示目標蛋白的相對表達量。每個樣本設2個復孔，實驗重復3次。表達抑制率=(1-實驗組蛋白相對表達量/空白對照組蛋白相對表達量)×100%

1.2.5 四甲基偶氮唑藍(methyl thiazoly tetrazolium，MTT法)檢測抑制survivin表達對RASFs增殖的影響:取對數生長期的RASFs，轉染前24 h按5×103個/孔的比例將細胞接種到96孔板上，并根據上述分組，依照96孔板的參數說明規則進行轉染操作，在轉染6 h之后，完全更換其培養基，并在隔段培養24 h、48 h、72 h過程中，均在每孔中加入5 mg/mL濃度的MTT30 μL，37 ℃作用4 h，PBS輕微洗滌2次后每孔加入150 μL DMSO，室溫避光振搖15 min。每組細胞設3個復孔，測定490 nm波長下的吸光度(A)值。實驗重復3次。細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組A值/空白對照組A值)×100%。

1.2.6 細胞凋亡分析:采用TUNEL法檢測細胞凋亡。接種細胞至爬片后按上述方法轉染及分組，培養48 h后收集細胞爬片，按照試劑盒說明書進行操作?？稍诠忡R下去觀察細胞的染色情況，對于細胞核中，若是出現棕黃色顆粒，就表示是陽性細胞，也就是凋亡的細胞。對于每張爬片中，應用5個高倍鏡視野( 400×)計數其凋亡陽性細胞核數以及總細胞核數，則細胞凋亡率 = 陽性細胞核數/總細胞核數×100%，可取其平均值。

2 結果

2.1 Western blot檢測survivin蛋白表達 對于轉染48h之后，在實驗組以及陰性對照組與空白對照組中，其survivin蛋白的相對表達量是0.11±0.03、0.63±0.09、0.66±0.09(圖1)，實驗組顯著低于空白對照組和陰性對照組(F=68.13，P<0.05)，在陰性對照組和空白對照組之間，其差異無統計學意義。與空白對照組比較，實驗組survivin蛋白表達明顯下降，表達抑制率為83.3%。Western blot的結果與熒光實時定量PCR的結果一致，與陰性對照組和空白對照組相比較，轉染survivin- siRNA的實驗組RASFs細胞中，survivin蛋白被顯著抑制。見表1。

表1 轉染48 h后各組結果比較Tab.1 Comparison of the results after transfection 48 ±s)

*P<0.05，與陰性對照組比較，compared with the negative control group；#P<0.05，與空白對照組比較，compared with the blank control group

圖1 各組滑膜細胞survivin的蛋白表達量A：空白對照組；B：陰性對照組；C：實驗組Fig.1 The protein expression of Survivin in synovial cells of each groupA: Blank control group, B: Negative control group, C: Experimental group

2.2 survivin mRNA表達的實時熒光定量PCR檢測結果 在轉染48 h之后，在實驗組、陰性對照組以及空白對照組中，其survivin mRNA相對表達量分別是(21.0±2.6)%、(95.3±3.5)%、100%，實驗組顯著低于空白對照組以及陰性對照組(F=914.6，P<0.05)，同時，對比陰性對照組與空白對照組，其差異無統計學意義(F=0.065，P>0.05)。見表1。

2.3 survivin-siRNA干擾RASFs細胞后對其凋亡的影響 轉染48 h后，實驗組細胞凋亡率為(23.87±1.6)%，與空白對照組(8.70±1.09)%和陰性對照組(9.72±1.15)%比較，實驗組細胞凋亡率明顯增加(F=167.10，P<0.05 )。在陰性對照組和空白對照組中的細胞凋亡率，差異無統計學意義(F=0.30，P>0.05)，提示干擾survivin基因表達后促進了RASFs細胞的凋亡。見表1。

2.4 MTT法檢測各組細胞增殖活性 轉染24 h后實驗組細胞生長速度較空白對照組和陰性對照組減慢(F=18.58，P<0.05)，生長抑制率為(11.5±2.6)%，轉染48 h后細胞增殖能力較空白組和陰性對照組受到明顯抑制(F=112.44，P<0.05)，生長抑制率為(26.2±3.4)%。轉染72 h后，實驗組細胞生長抑制率為(47.6±4.1)%，與對陰性照組比較，實驗組細胞的生長抑制則更為明顯 (P<0.05)；在陰性對照組與空白對照組中，在轉染后各個時點中，其細胞生長抑制率差異無統計學意義。見表2。

組別24h48h72h空白對照組0.159±0.0070.170±0.0040.185±0.007實驗組0.136±0.006*#0.126±0.005*0.097±0.005*陰性對照組0.156±0.0050.167±0.0050.186±0.004F值18.58112.44340.23p值0.0010.0010.001

*P<0.05，同一轉染時間與陰性對照組比較，compared with the negative control group at the same transfection time；#P<0.05，同一轉染時間與空白對照組比較，compared with the blank control group at the same transfection time

3 討論

正常的滑膜組織僅由1～2層細胞構成，而RA可增至8～10層，這些過度增殖的滑膜細胞向關節軟骨及骨組織浸潤性生長，最后導致關節畸形及功能障礙[9]。RA滑膜成纖維細胞凋亡異常在RA的疾病發展中起到關鍵作用，最終導致滑膜病理性增生、關節軟骨破壞等一系列病理生理改變[3]。在Ahn JK等人研究中，應用免疫組化的方法，發現在RA關節滑膜成纖維細胞中，survivin表達的水平高于正常人，認為滑膜成纖維細胞是形成產生survivin的一個重要來源；在凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族中，survivin是具有可以抑制細胞發生凋亡，在其研究中表明，在常見的惡性腫瘤中亦可發現survivin的高表達[11]。對于RA患者中，可發現在滑膜細胞、滑液以及外周血中，均有survivin高表達發生，而對于正常成熟滑膜細胞以及骨骼組織之中，則無survivin表達異常，且survivin的表達與RA病情活動及骨侵蝕程度呈正相關，而抗Survivin抗體與關節侵蝕呈負相關，同時發現，RA患者經抗風濕藥物(DMARS)治療后，以及對于改善病情的RA患者，其滑膜細胞中的Survivin高表達水平有明顯降低趨勢；臨床中，應用Survivin反義寡核昔酸，也可下調IL-6炎性因子，這些研究使得survivin靶向治療類風濕關節炎成為可能[4-7]。

RNA干擾(RNA interference RNAi)，就是在短雙鏈RNA誘導以及同源mRNA之間的降解過程中，能夠對基因沉默，運用RNAi干擾技術，可以在細胞基因轉錄后，抑制基因水平表達，可研究控制基因功能[12]。本研究合成靶向survivin的siRNA，轉染RA滑膜成纖維細胞，48h后滑膜成纖維細胞survivin的mRNA及蛋白表達水平明顯下降。實驗組survivin基因mRNA相對表達量為(21.0±2.6)%，蛋白的相對表達量為(0.11±0.03)，與陰性對照組以及空白對照組進行比較，P<0.05，細胞凋亡在陰性對照組和空白對照組中進行比較，則差異無統計學意義，進一步證實轉染特異性survivin-siRNA在一定程度抑制了RA滑膜成纖維細胞survivin基因mRNA及蛋白水平的表達，而陰性序列siRNA對survivin的表達無影響。轉染后24 h、48 h、72 h實驗組細胞與陰性對照與空白對照組進行比較，其細胞的增殖能力產生下降，其差異有統計意義(P<0.05)，細胞增殖的抑制效應于轉染24 h后出現，隨著時間的增加抑制效應遞增。細胞凋亡檢測證明轉染48h后實驗組凋亡率為(23.87±1.6)%，較陰性對照組和空白對照組顯著增加(P<0.05)，證明下調survivin基因的表達可促進RASFs細胞凋亡。

綜上所述，本研究證實了靶向沉默survivin表達有抑制RA滑膜成纖維細胞增殖及促進其凋亡的作用，提示survivin可能在RA滑膜病理性增生的調控中具有重要作用，從而具有作為基因靶點治療RA的潛能。

[1] Woods JM,Katschke KJ Jr, Tokuhira M, et al. Reduction of inflammatory cytokines and prostaglandin E2 by IL-13 gene therapy in rheumatoid arthritis synovial [J].J Immunol, 2000, 165(5): 2755-2756.

[2] Firestein GS. Evolving concepts of rheumatoid arthritis[J].Nature,2003,423(6837)：356-361.

[3] Baftok B,Firestein GS. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis[J].Immunol Rev,2010, 233(1):233-235.

[4] Kelly RJ, Lopez Chavez A, Citrin D, et al. Impacting tumor cell fate by targeting the inhibitor of apoptosis protein survivin[J].Mol Cancer， 2011(10):35.

[5] Svensson B, Hafstrom L, Forslind K, et al. Increased expression of proto-oncogene survivin predicts Joint destruction and persistent disease activity in early rheumatoid arthritis[J].Ann Med, 2010, 42 (1): 45-54.

[6] Ahn JK, Oh JM, Lee J, et al. Increased extracellular survivin in the synovial fluid of rheumatoid arthritis patients: fibroblast-like synoviocytes as a potential source of extracellular survivin[J].Inflammation, 2010, 33(6): 381-388.

[7] 趙金霞，王志敏，栗占國. 以抗環瓜氨酸肽抗體改進對1987年美國風濕病學會關于類風濕關節炎分類標準的探討[J].中華風濕病學雜志，2009，13(4)：236-239.

[8] Schmittgen TD,Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method[J].Nat Protoc 2008,3(6):1101-1108.

[9] Hoss EH，Brenner MB.The role and therapeutic implications of fibroblast-like synoviocytes in inflammation and cartilage erosion in rheumatoid arthritis[J].Immunol Rev, 2008(223):252-270.

[10] Ahn JK, Oh JM, Lee J, et al. Increased extracellular survivin in the synovial fluid of rheumatoid arthritis patients: fibroblast-like synoviocytes as a potential source of extracellular survivin[J].Inflammation, 2010, 33(6): 381-388.

[11] Szafer-Glusman E, Fuller MT, Giansanti MG.Role of survivin in cytokinesis revealed by a separation-of-function allele[J].Mol Biol Cell，2011，22(20):3779-3790.

[12] Goyal BR, Patel MM, Soni MK,et al. Therapeutic opportunities of small interfering RNA[J].Fundam Clin Pharmcol, 2009,23(4):367-386.

(編校：譚玲)

siRNA inhibition of survivin gene expression in rheumatoid arthritis synovial fibroblast proliferation and apoptosis

MA Sha1, LIN Jun1Δ, JIN Song1, LI Qin1, ZHANG Hong1, YU Liang2

(1. Department of Rheumatism and Immunology, Yunnan First People’s Hospital, Kunming 650032, China; 2.Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Genetics, Kunming 650118, China)

ObjectiveTo study the targeting survivin small interfering RNA (siRNA) to inhibit proliferation and apoptosis survivin gene expression in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts (RASFs).MethodsRA patients were isolated and cultured in vitro synovial fibroblasts (RASFs), designed and synthesized siRNA targeting survivin and negative control, by liposome transfection RASFs cell; real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) and Western blot RASFs detect mRNA expression and protein levels of survivin. Tetrazolium blue (MTT) assay of cell proliferation; TUNEL assay apoptosis.ResultsThe experimental group compared with the negative control siRNA group and control group, 48h after transfection of synovial fibroblasts survivin mRNA and protein expression levels were significantly decreased(P<0.05). The experimental group compared with the negative control siRNA group and control group, synovial fibroblast proliferation after transfection significantly decreased(P<0.05). After the experimental group transfected 24h, 48h, 72h growth inhibition rates were (11.5±2.6)%, (26.2±3.4)%, (47.6±4.1)%, at 72 hours after transfection most significant. The rate of apoptosis in experimental group (23.87±1.6)%, significantly higher than the negative control group (9.72±1.15)% and the control group (8.70±1.09)% (allP<0.05). ConclusionsiRNA targeting survivin expression levels through reducing survivin, inhibit synovial fibroblast proliferation and promotes apoptosis.

survivin; rheumatoid arthritis; synovial fibroblast-like cells; siRNA; apoptosis

云南省科技廳昆明醫科大學聯合專項基金(2011FB215)

馬莎，女 ，碩士，主治醫師，研究方向：自身免疫性疾病的臨床及基礎研究，E-mail：15925203463@126.com；林俊，通信作者,女，本科，副主任醫師，研究方向：彌漫性結締組織病的診治，E-mail：lunjun06@sina.com。

R593.22

A

1005-1678(2015)12-0017-04