阿司匹林抵抗患者的基因多態性研究

孫洲亮，賈俊婷，肖惠玲

(廈門大學附屬第一醫院 藥學部，福建 廈門 361003)

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阿司匹林抵抗患者的基因多態性研究

孫洲亮Δ，賈俊婷，肖惠玲

(廈門大學附屬第一醫院 藥學部，福建 廈門 361003)

目的 探究阿司匹林抵抗患者COX-1、P2Y1、GPIa及GPIIIa基因多態性。方法 收集動脈粥樣硬化阿司匹林抵抗患者35例，患者予以阿司匹林腸溶片口服治療，14天后測定每位患者COX-1、P2Y1、GPIa及GPIIIa基因多態性進行對比分析。結果 COX1(A-842G)位點基因型為AA及COX1(C50T)位點基因型為CC檢測比例較高，與其他基因比較差異具有統計學意義(P<0.05)；P2Y1(A1622G)位點基因型為AG；P2Y1(C893T)位點基因型為CC檢測比例較高，與其他基因比較差異具有統計學意義(P<0.05)；GPIa(C807T)位點基因型為CT；GPIa(G873A)位點基因型為GA檢測比例較高，與其他基因比較差異具有統計學意義(P<0.05)；GPⅢa(T1565C)位點基因型為TT比例較高，與其他基因比較差異具有統計學意義(P<0.05)。結論 P2Y1 (C893T)、GPIa(C807T) 等位基因與阿司匹林抵抗具有相關性，與COX-1(A-842G、C50T)、GPIa(G873A)、GPⅢa(T1565C)、P2Y1(A1622G)等位基因相比更易誘導阿司匹林抵抗的發生。

COX-1；P2Y1；GPIa；GPIIIa；基因多態性；阿司匹林抵抗；相關性

阿司匹林是一種在心腦血管病防治中起關鍵作用的抗血小板聚集藥，可有效抑制血小板活化以及聚集，預防血栓形成，血小板活化和聚集在動脈粥樣硬化血栓形成的發病機制中起著關鍵作用，也是導致急性冠狀動脈(冠脈)綜合征(ACS)的直接原因，臨床常用于心腦血管病的一級和二級防治[1]。阿司匹林已被廣泛應用于心腦血管病患者及其高危人群，多項循證醫學證實長期口服阿司匹林可減少心血管事件，然而阿司匹林抗血小板作用具有個體差異性，部分患者由于長期服用，存在阿司匹林抵抗(aspirin resistance，AR)，其心腦血管病的發生率以及病死率并未降低，其發生機制不明確[2]。因此人群中慢性疾病遺傳機制和藥物治療的有效性研究是當今醫學領域的重點課題，尤其是基因多態性與阿司匹林抵抗的相關性?，F代研究表明，COX-1、P2Y1、GPIa及GPIIIa等的基因多態性與阿司匹林抵抗密切相關。本研究擬通過檢測動脈粥樣硬化高危中國漢族人群中環氧化酶-1 (COX-1)(A-842G、C50T)、血小板膜糖蛋白GPIa(C807T、G873A)、血小板膜糖蛋白GPⅢa(T1565C)和5-二磷酸腺苷受體P2Y1(A1622G、C893T)多態性的基因頻率分布及其與阿司匹林抵抗的相關性，旨在為心腦血管疾病患者抗血小板聚集的個體化治療方案提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年7月～2015年8月廈門大學附屬第一醫院心內科、高干科收治動脈粥樣硬化阿司匹林抵抗患者35例，男性20例，女性15例，年齡45～78歲，平均年齡(61.31±8.24)歲，患者的一般情況相仿，差異無統計學意義，具有可比性。

納入標準[3]：所有患者均符合以下條件：①診斷符合阿司匹林抵抗判定標準具備以下臨床特點：AA誘導的血小板聚集率≧20% ；ADP誘導的血小板聚集率≧70%；②漢族，年齡20-80歲，患者病情控制穩定，能配合實驗；③因動脈粥樣硬化服用阿司匹林(100 mg/d)至少14 d以上；④患者均為自愿參與本實驗，有完善的就診資料，并簽署知情同意書。本實驗獲得本院倫理委員會批準。

排除標準：①藥物過敏史，接受免疫抑制劑或低分子肝素抗凝藥物治療的患者，服用影響血小板功能類藥物，阿司匹林過敏，出血傾向，血液疾病血小板計數>400×109/L或<100×109/L，血紅蛋白>169或<100 g/L，消化性潰瘍病史；②急慢性感染性疾病以及嚴重心、肝、腎等多臟器功能障礙或衰竭；③惡性腫瘤、癲癇等神經系統疾病。

剔除標準：①患者住院期間或出院后無法規律服用或未按時服用阿司匹林抗血小板治療；②服藥期間抽煙、飲酒；③更改阿司匹林規格服用。

脫落、中止試驗標準：①患者在實驗期間出現嚴重的不良事件；②患者在實驗過程中出現嚴重的合并疾??；③受試者依從性較差差(試驗用藥依從性低于80%或超過120%)或期間應用除本方案外的其他禁止使用的中西藥，更換換藥或使用其他藥物者。

1.2 方法

1.2.1 試驗用藥：患者均持續服用拜阿司匹林腸溶片(上海海虹實業(集團)巢湖今辰藥業有限公司，國藥準字H34021119)，口服100 mg/片；1次/天，持續服藥≥14天。

1.2.2 觀察指標：采取清晨空腹肘部靜脈血5 mL，不抗凝，靜置后以2000 r/min離心20 min，分離血清置于-20 ℃冰箱保存待測，嚴格按照試劑盒以及儀器說明書步驟操作，檢測血清葡萄

糖、血常規、LDL、HDL、甘油三酯等臨床指標；另一管標本用于提取DNA，通過焦磷酸測序法測定COX-1(A-842G、C50T)、GPIa(C807T、 G873A)、GPⅢa(T1565C)、P2Y1(A1622G、C893T)等位點的基因多態性。

2 結果

2.1 COX1基因多態性檢測結果 COX1(A-842G)位點基因型為AA及COX1(C50T)位點基因型為CC檢測比例高于其他可見基因型(P<0.05)。見表1。COX1(A-842G)目標基因位點野生型標準序列：GCTGGACACTG(下劃線為多態位點野生型位點)；突變型序列：GCTGGGCACTG(下劃線為突變型位點)；檢測結果序列： GCTGGACACTG(結果為野生型，見圖1下劃線)。COX1(C50T)目標基因位點野生型標準序列：GCTCCCGCCGC(下劃線為野生型位點)；突變型序列：GCTCCTGCCGC(下劃線為突變型位點)；檢測結果序列： GCTCCCGCCGC(結果為野生型，見圖2下劃線序列)。

表1 COX1中可見基因所占比例(n，%)Tab.1 Proportion of visible genes in COX1(n，%)

*P<0.05，與AA基因型比較，compared with the AA genotype；#P<0.05，與CC基因型比較，compared with with the CC genotype

圖1 COX1(A-842G)(正測)Fig.1 COX1(A-842G)(positive test)

圖2 COX1(C50T)(正測)Fig.2 COX1(C50T)(positive test)

2.2 P2Y1基因多態性檢測結果 P2Y1(A1622G)位點基因型為AG及P2Y1(C893T)位點基因型為CC檢測比例高于其他基因(P<0.05)。見表2。P2Y1(A1622G)目標基因位點野生型標準序列：CTGGTAATCAT(下劃線為野生型位點)；突變型序列：CTGGTGATCAT(下劃線為突變型位點)；檢測結果序列：CTGGTA/GATCAT(結果為突變雜合子，見圖3下劃線)。P2Y1(C893T)目標基因位點野生型標準序列：CTGGCCGGTCC(下劃線為多態位點野生型位點)；突變型序列：CTGGCTGGTCC(下劃線為多態位點突變型位點)。檢測結果序列：CTGGCCGGTCC(結果為野生型，見圖4下劃線)。

表2 P2Y1中可見基因所占比例(n，%)Tab.2 Proportion of visible genes in P2Y1(n，%)

*P<0.05，與AG基因型比較，compared with the AG genotype；#P<0.05，與CC基因型比較，compared with CC genotype

圖3 P2Y1(A1622G)(正測)Fig.3 P2Y1(A1622G)(positive test)

圖4 P2Y1(C893T)(正測)Fig.4 P2Y1(C893T)(positive test)

2.3 GPIa基因多態性檢測結果 GPIa(C807T)位點基因型為CT及GPIa(G873A)位點基因型為GA檢測比例高于其他基因型(P<0.05)。見表3。GPIa(C807T)目標基因位點野生型標準序列：ACATTCGGAGC(下劃線為野生型位點)；突變型序列：ACATTTGGAGC(下劃線為突變型位點)。檢測結果序列： ACATTC/TGGAGC(結果為突變雜合子，見圖5下劃線序列)。GPIa(G873A)目標基因位點野生型標準序列：ACATTCGGAGC(下劃線為野生型位點)；突變型序列：ACATTTGGAGC(下劃線為突變型位點)。結果序列： ACATTC/TGGAGC(結果為突變雜合子，見圖6下劃線序列)。

表3 GPIa中可見基因所占比例(n，%)Tab.3 Proportion of visible genes in GPIa(n，%)

*P<0.05，與CT基因型比較，compared with the CT genotype；#P<0.05，與GA基因型比較，compared with GA genotype

圖5 GPIa(C807T)(正測)Fig.5 GPIa(C807T)(positive test)

圖6 GPIa(G873A)(正測)Fig.6 GPIa(G873A)(positive test)

2.4 GPⅢa基因多態性檢測結果 GPⅢa(T1565C)位點基因型為TT(32，91.43%)，高于其他基因型CC(2，5.71%)、TC(1，2.86%)(P<0.05)。目標基因位點野生型標準序列：GCCTCTGGGCT(下劃線為野生型位點)；突變型序列：GCCTCCGGGCT(下劃線為突變型位點)；結果序列： GCCTCTGGGCT(結果為野生型，見圖7下劃線序列)。

圖7 GPⅢa(T1565C)(正測)Fig.7 GPⅢa(T1565C)(positive test)

3 討論

心腦血管疾病已成為威脅國民健康的頭號殺手，統計學顯示，全世界每年死于心腦血管疾病的人數高達1500萬人，居各種死因首位，我國每年死于心腦血管疾病近300萬人[4]。阿司匹林作為一種有效的抗血小板聚集藥物，用于缺血性心臟病、心絞痛、腦血栓形成以及心肺梗塞的等心腦血管疾病的防治，減少高危心肌梗死、心源性猝死以及腦卒中的發生率，醫學界稱之為“萬靈藥”[5]。臨床觀察顯示阿司匹林作為腦梗死的預防和治療藥物被廣泛應用，能減少約25%的心腦血管事件復發[6]。然而，并不是所有患者都能從阿司匹林治療中獲益，約有0.4%～83.3%的心腦血管患者對阿司匹林的抗血小板療效不敏感，患者仍存在缺血性血管事件的發生，臨床上將此類患者稱為阿司匹林抵抗(aspirin resistance AR)[7]。阿司匹林抵抗廣泛存在于正常健康機體、心腦血管疾病患者以及外周血管病患者中，發生率高達8%～45%，研究人員開始重視這一問題，因此，對阿司匹林抵抗人群的早期區分，可明顯改善缺血性血管事件發生的危險性，具有良好的預防和治療的作用。

阿司匹林抵抗的發生機制現代學者尚未研究清楚，猜測可能與阿司匹林使用劑量、患者對藥物的依從性、血小管旁路激活途徑以及基因多態性等多素因素具有相關性?；蚨鄳B性是從藥物遺傳多態性方面研究，表現為藥物代謝酶、轉運蛋白和作用靶點具有多態性。研究發現[8]，遺傳可能是AR發生的重要因素，基因變異可能是患者對ASA敏感性以及特異性降低的主要原因。目前國內對于血小板活化路徑及基因多態性的研究，結合阿司匹林抵抗人群，針對以下幾個方面進行開展：血栓素激活途徑中編碼環氧合1(cycloxygenase1，COX1)的基因多態性；GPⅡb/Ⅲa激活途徑中編碼血小板膜GPⅢa的血小板抗1/血小板抗原2 (platelet antigen1/platelet antigen2，PLA1/PLA2)多態性；膠原激活途徑中編碼血小板膜GPⅠa/GPⅡa的807C/T和873G/A多態性；二磷酸腺苷(ADP)受體P2Y1的基因多態性。臨床對于以上多態性位點對阿司匹林有抗血小板作用相關性早有猜測，但并未證實[9]。

COX是一種參與前列腺素合成的重要限速酶，有兩種同工酶分別是COX-1以及COX-2，阿司匹林抵抗這兩種酶，抑制前列腺素的分泌，其中COX-1絲氨酸530發生不可逆的乙?；饔茫姑甘Щ?，抑制TXA2的生成，研究發現COX基因多態性具有多個位點。二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)是人類最早發現的誘導血小板聚集的重要物質，對血小板表面G蛋白與P2Y受體的連接進行調節，從而誘導兩種血小板聚集的發生[10]?，F代研究已發現8種P2Y受體亞型被克隆，達到進一步完善P2Y1以及P2Y12的研究的目的。ADP通過受體的突變與止血異常的作用，促進P2Y1和P2Y12受體刺激血小板的激活和聚集，受體的抑制作用誘導血小板聚集作用降低[11]。血小板膜糖蛋白Ia/IIa屬于血小板質膜糖蛋白，其密度增加是誘發血栓形成以及多種心血管事件發生的潛在危險因素，影響患者阿司匹林抵抗[12]。 血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa是一種細胞黏附受體整合素，具有介導細胞以及外環境的跨膜受體，在血小板黏附以及聚集中將有關信息進行傳導，參與血小板黏附和聚集，誘導血小板功能變性[12]。曾有學者猜測，AR與血小板膜GPⅡb/Ⅲa受體復合物的多態性具有緊密聯系，GPⅡb/Ⅲa受體是血小板活化的最后共同通路[13]。GPⅡb/Ⅲa基因(包括編碼GPⅡb和GPⅢa的基因)發生突變、缺失或插入等一系列生理病理改變，進而發生表型改變，導致血小板功能變性。國外學者經過研究發現，GPⅢa多態性有C157T、A1163C、A1553G以及T1565C等多個位點，其中外顯子2第1565位氨基酸的突變臨床最常見，即T1565C(Leu33Pro)，編碼Leu的位點稱為PLA1(HPA-1a)，編碼Pro的位點稱為PLA2(HPA-1b)。

本研究通過對我院收治35例動脈粥樣硬化阿司匹林抵抗患者COX-1、P2Y1、GPIa及GPIIIa基因多態性進行研究，證實了P2Y1 (C893T)、GPIa(C807T) 等位基因與阿司匹林抵抗具有相關性，與COX-1(A-842G、C50T)、GPIa(G873A)、GPⅢa(T1565C)、P2Y1(A1622G)等位基因相比更易誘導阿司匹林抵抗的發生。

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(編校：譚玲)

Study on gene polymorphism in patients with aspirin resistance

SUN Zhou-liangΔ, JIA Jun-ting, XIAO Hui-ling

(Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361003, China)

ObjectiveTo explore the correlation between aspirin resistance and COX-1, P2Y1, GPIa and GPIIIa gene polymorphism.Methods35 case with aspirin resistant were selected and were given aspirin enteric coated tablets for oral treatment, 14 days. After the determination COX-1, P2Y1 and GPIa and GpIIIa gene polymorphism of each patient were analysis.ResultsThe genotype AA of COX1 (A-842G) locus and CC of COX1 (C50T) locus was higher than other genotype (P<0.05);AG of P2Y1 (A1622G) locus genotype and CC of P2Y1 (C893T) locus genotype was higher than other genotype (P<0.05);CT of GPIa (C807T) locus genotype and GA of GPIa (G873A) locus genotype was higher than other genotype (P<0.05);PLA1/A1 of GPⅢa(T1565C)locus genotype was higher than other genotype (P<0.05).ConclusionP2Y1 (C893T), GPIa (C807T) allele is associated with aspirin resistance,With COX-1 (A-842G, C50T), GPIa (G873A), GP III A (T1565C), P2Y1 (A1622G) allele is more likely to induce the occurrence of aspirin resistance.

COX-1; P2Y1; GPIa; GPIIIa; gene polymorphism; aspirin resistance; correlation

福建省衛計委中青年骨干項目(2014-ZQN-JC-41)

孫洲亮，通信作者，男，碩士，副教授、碩士生導師，研究方向：藥物基因組學，E-mail:sunzhouliang@126.com。

R543

A

1005-1678(2015)12-0042-04