炔基化聚天冬酰胺開環衍生物的合成及生物相容性研究

高紅林，韓京華，楊翠紅，劉雅潔，宋娜玲Δ，王燕銘Δ

(1.北京協和醫學院&中國醫學科學院放射醫學研究所，天津市放射醫學與分子核醫學重點實驗室，天津 300192；2.南開大學 藥學院 藥物化學生物學國家重點實驗室，天津 300071)

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炔基化聚天冬酰胺開環衍生物的合成及生物相容性研究

高紅林1，韓京華2，楊翠紅1，劉雅潔2，宋娜玲1Δ，王燕銘2Δ

(1.北京協和醫學院&中國醫學科學院放射醫學研究所，天津市放射醫學與分子核醫學重點實驗室，天津 300192；2.南開大學 藥學院 藥物化學生物學國家重點實驗室，天津 300071)

目的 合成一種新的炔基化聚天冬酰胺-g-苯丙氨酸衍生物用作功能化藥物載體。方法 以L-苯丙氨酸為原料制備苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽，對聚琥珀酰亞胺(polyasparamide, PSI)進行開環反應得到聚天冬酰胺-g-苯丙氨酸衍生物PSI-Phe-OMe，使用炔丙胺進一步開環得到炔基化的聚天冬酰胺-g-苯丙氨酸衍生物PSI-Phe-OMe-PA；通過1HNMR進行聚合物結構確證；通過MTT法、顯微觀察法和碘化丙啶(PI)染色法等確定PSI-Phe-OMe-PA對細胞增殖、形態以及細胞周期的影響。結果1HNMR確證了PSI-Phe-OMe-PA的分子結構，苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽對PSI的開環率為40%，炔丙胺進一步開環后可使開環率接近100%；MTT實驗表明PSI-Phe-OMe-PA對NIH 3T3 和HepG2 2種細胞的毒性較小，在濃度為100 μg/mL時細胞存活率仍在80%左右，且對細胞形貌和細胞周期無顯著影響。結論 苯丙氨酸甲酯和炔丙胺可依次對聚琥珀酰亞胺進行開環合成炔基化的聚天冬酰胺開環衍生物PSI-Phe-OMe-PA，且PSI-Phe-OMe-PA是一類安全的功能化藥物載體。

聚天冬酰胺衍生物；炔基化；藥物載體；生物相容性

聚天冬酰胺類材料因具有生物相容性好、可降解和易修飾等優點被認為是一種有應用前景的藥物控釋材料[1-3]。理想的藥物載體需要具備高載藥量、可實現藥物靶向緩控釋等智能響應的特性[4-6]。因此，對傳統天然類藥物載體材料的生物改性成為必然趨勢。采用不同的開環試劑對聚琥珀酰亞胺(polysuccinimide, PSI)進行開環可以使其易于進行功能化修飾，因此可賦予PSI衍生物更加廣闊的應用前景。Zhao等[7]設計pH敏感聚天冬酰胺的肼解產物聚天冬酰肼(PAHy)作為阿霉素的載體用作抗腫瘤治療。Chen等[8]合成了星狀聚天冬氨酸-琥珀酰亞胺共聚物納米載體用于植物韌皮部藥物輸送。本文旨在利用L-苯丙氨酸甲酯上的氨基和炔丙胺對PSI依次進行開環反應從而構建適于應用的功能化藥物載體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：聚琥珀酰亞胺(PSI，實驗室自制，粘均分子量為50kDa)；L-天冬氨酸、環丁砜、均三甲苯、L-苯丙氨酸和炔丙胺(Alfa Aesar，美國)；細胞培養耗材(Corning，美國)；胎牛血清、RPMI 1640細胞培養基、胰蛋白酶和3-(4，5)-雙甲基-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑藍(MTT，Gibco，美國)；碘化丙啶(Propidium Iodide，PI，Sigma，美國)；其他試劑均購自天津試劑六廠。

1.1.2 細胞株：NIH 3T3(小鼠胚胎成纖維細胞系)和HepG2(人肝癌細胞系)細胞，為本實驗室保存。

1.1.3 儀器：電子分析天平(BT124S，Sartorius)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S，予華儀器)；旋轉蒸發器(SB-1000，東京理化器械)；核磁共振儀(1H NMR，Bruker ARX 400，瑞士)；倒置熒光顯微鏡(DMI 3000B，Leica，德國)；全波長多功能酶標儀(Varioskan Flash，THERMO，美國)；流式細胞儀(Accuri C6，Accuri Cytometers，美國)。

1.2 方法

1.2.1 化學合成及結構表征

① 苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽(Phe-OMe·HCl)的合成：在0 ℃條件下向40 mL無水甲醇中逐滴加入8.8 mL氯化亞砜，滴加完畢后溫度上升至室溫，繼續攪拌0.5 h，然后緩慢加入L-苯丙氨酸，溫度上升至80 ℃，回流反應10 h。反應液冷卻后滴入乙醚中得到白色沉淀苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽備用。

② PSI-Phe-OMe的合成：Phe-OMe·HCl的氨基可以對PSI進行開環反應，同時使開環聚合物帶有甲酯側鏈。取PSI 500 mg溶于5 mL DMF中，加入3.69 g Phe-OMe·HCl，三乙胺2.8 mL，于60 ℃下反應24 h，將反應液冷卻后滴入無水乙醚中沉淀，得到淡黃色固體粉末即為聚合物PSI-Phe-OMe。

③ PSI-Phe-OMe-PA的合成：炔基是點擊化學的一個重要反應基團，可以與疊氮形成三唑環，該反應易于進行且專屬性強，可以在聚合物主鏈上引入更豐富的基團或側鏈。使用炔丙胺與剩余的琥珀酰亞胺單元反應，使炔基連接到聚合物鏈上。取PSI-Phe-OMe 500 mg溶于5 mL DMF中，緩慢加入炔丙胺 0.13 mL，

40 ℃下攪拌反應96 h。將反應液用5 mL蒸餾水稀釋，轉入截留分子量為8 kDa的透析帶中透析48 h，透析液為蒸餾水。將透析袋中溶液置于冷凍干燥機中凍干，得到淡黃色固體即為目標聚合物PSI-Phe-OMe-PA。聚合物結構表征通過核磁共振氫譜進行測定。

1.2.2 細胞毒性檢測：采用MTT法和細胞微觀形態觀察研究聚合物PSI-Phe-OMe-PA的細胞毒性。NIH 3T3和HepG2細胞，用RPMI 1640培養基(含10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素)在37 ℃，5%CO2的培養箱中培養。MTT實驗中按1×104細胞/孔接種96孔板，培養24 h。用含不同濃度聚合物(0、1、2、5、10、100 μg/mL，0 μg/mL為對照組，其余為實驗組)的RPMI 1640培養基置換細胞培養液繼續培養24 h。按照20 μL/孔向培養液中加入MTT(5 mg/mL)繼續培養4 h，加入二甲基亞砜，室溫避光震蕩裂解10 min后用全波長多功能酶標儀測定OD 490，按照以下公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)= 實驗組OD490/對照組OD490×100。

細胞微觀形態觀察實驗中按5×104HepG2細胞/孔接種24孔板，培養24 h。用含聚合物濃度為50 μg/mL的RPMI 1640培養基繼續培養24 h后于倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3 細胞周期檢測：為考察PSI-Phe-OMe-PA對細胞周期的影響，利用碘化丙啶(PI)染色法通過流式細胞儀分析細胞周期的變化。細胞培養方法同1.2.2中細胞微觀形態觀察法。聚合物(濃度為50 μg/mL,為實驗組，以不加聚合物為對照組)孵育24 h后，消化、離心收集細胞后加入500 μL 碘化丙啶染液(PI，50 μg/mL，含100 μg/mL RNase A和0.2%Triton X-100)，4 ℃避光孵育0.5 h，流式細胞儀收集2×104細胞檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，2組間比較進行t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PSI-Phe-OMe-PA合成及結構表征 利用L-苯丙氨酸甲酯上的氨基對PSI進行開環得到聚合物PSI-Phe-OMe，使PSI在開環后帶有苯丙氨酸甲酯側枝，然后使用炔丙胺進行進一步開環反應得到終產物PSI-Phe-OMe-PA。見圖1。

圖1 苯丙氨酸甲酯(a)和聚合物PSI-Phe-OMe-PA(b)的合成路徑Fig.1 Synthetic routes of L-phenylalanine methyl ester hydrochloride (a) and target compound PSI-Phe-OMe-PA (b)

核磁共振氫譜顯示聚合物PSI-Phe-OMe-PA的結構是正確的。見圖2。4.44 ppm和3.82 ppm處的信號峰為炔丙胺特征峰，同時5.29 ppm處環上亞甲基特征峰僅有少量殘留，說明反應接近完全，即炔丙胺使剩余的琥珀酰亞胺環完全打開。7.20 ppm處苯環峰和3.82 ppm處甲基峰顯示苯丙氨酸甲酯結構完好。采用內標法磁氫譜計算其開環率約為40%。

圖2 PSI-Phe-OMe-PA的1H核磁表征Fig.2 1H NMR spectrum of PSI-Phe-OMe-PA

2.2 細胞相容性分析 目標聚合物PSI-Phe-OMe-PA用作藥物載體對細胞毒性以及對細胞周期的影響結果顯示：隨著聚合物濃度的增加，細胞存活率有一定的下降，但在聚合物濃度<100 μg/mL時2種細胞的存活率仍在80%左右。見圖3。與對照組相比，50 μg/mL的聚合物處理24 h對HepG2細胞的微觀形貌沒有產生明顯影響。見圖4。50 μg/mL聚合物對于NIH 3T3細胞和HepG2細胞的細胞周期分布無顯著影響。見圖5。

圖3 PSI-Phe-OMe-PA處理24 h對NIH 3T3細胞和HepG2細胞的毒性Fig.3 Toxicity of PSI-Phe-OMe-PA on NIH 3T3 celland HepG2 cell for 24 hours

圖4 HepG2細胞的形貌觀察A:HepG2對照細胞；B:PSI-Phe-OMe-PA (50 μg/mL)處理24 h的HepG2細胞標尺均為50 μmFig.4 Morphology of HepG2 cell treated with PSI-Phe-OMe-PA for 24 hoursA:control(0 μg/mL);B:treated with PSI-Phe-OMe-PA(50 μg/mL)All scale bars were 50 μm

圖5 PSI-Phe-OMe-PA(50 μg/mL)處理24 h對NIH 3T3細胞(A)和HepG2細胞(B)細胞周期的影響Fig.5 Effect of PSI-Phe-OMe-PA (50 μg/mL) on cell cycles of NIH 3T3 cell(A) and HepG2 cell(B) for 24 hours

3 討論

聚琥珀酰亞胺(PSI)是通過L-天冬氨酸熱縮聚合而成，易在堿性條件下水解成天冬氨酸聚合物或水凝膠，或通過親水性氨基等功能基團修飾形成水溶性好、生物相容性高的聚天冬氨酸衍生物。PSI及其衍生物的這種堿性響應性、生物可降解性以及易于進行功能化修飾的特性使其在藥物控釋領域顯示出廣闊的應用前景[9-10]。本文采用L-苯丙氨酸甲酯對PSI進行開環，一方面L-苯丙氨酸甲酯的氨基可以打開一部分PSI的琥珀酰亞胺單元，另一方面，L-苯丙氨酸結構的苯環可與含苯環的藥物分子如布洛芬、環丙沙星等形成π-π共軛作用[11]，從而增大聚合物的載藥能力。磁共振氫譜結果顯示L-苯丙氨酸甲酯對PSI的開環率約為40%，為后續作為藥物載體應用奠定了結構基礎。

點擊化學(Click chemistry)已經成為目前最吸引人的合成理念之一，因點擊化學反應專一性強、可調控強，已廣泛用于生物醫用材料和藥物研發等領域[12-13]。本文利用炔丙胺對PSI進行進一步開環反應，在苯丙氨酸甲酯結構完整的前提下可基本完全打開PSI-Phe-OMe中的琥珀酰亞胺環得到炔基化的聚天冬酰胺-g-苯丙氨酸衍生物。炔基化可賦予聚合物載體通過點擊化學連接其他功能基團的特性，如可連接親水基團聚乙二醇(PEG)，使聚合物具有兩親性，能夠更好地形成載藥納米顆粒并在水相中維持穩定的結構等[14]。

藥物載體的生物性能對于其能否用于體內藥物輸送具有重要的意義[15]。細胞毒性和細胞周期評價顯示通過L-苯丙氨酸甲酯和炔丙胺兩步開環反應得到的炔基化聚天冬酰胺開環衍生物PSI-Phe-OMe-PA具有良好的細胞相容性，是一種潛在的功能化藥物載體。

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(編校：吳茜)

Synthesis and biocompatibility of ethynylated open ring derivatives of polyasparamide

GAO Hong-lin1, HAN Jing-hua2, YANG Cui-hong1, LIU Ya-jie2, SONG Na-ling1Δ, WANG Yan-ming2Δ

(1.Tianjin Key laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine, Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Tianjin 300192, China; 2.State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Pharmacy, Nankai University, Tianjin 300071, China)

ObjectiveTo synthesize a new ethynylated open ring derivatives of polyasparamide as functional drug carrier.MethodsL-phenylalanine methyl ester hydrochloride was prepared using L-phenylalanine and then was used for ring opening reaction of polysuccinimide.To synthesize the target product of PSI-Phe-OMe-PA, the obtained polyasparamide-g-phenylalanine derivatives (PSI-Phe-OMe) was further ring opened by propargylamine.The structure of PSI-Phe-OMe-PA was confirmed by1H NMR.The biocompatibility of PSI-Phe-OMe-PA was evaluated by MTT method, inverted microscope observation and cell cycles analysis (propidium iodide staining).ResultsThe ring-opening rate of polyasparamide by L-phenylalanine methyl ester and propargylamine was 40%and 100%, respectively.All results of biocompatibility studies indicated that PSI-Phe-OMe-PA may be a good candidate for functional drug carrier.Conclusion Based on the ring-opening capability of amino-group and the specificity of click reaction, L-phenylalanine methyl ester hydrochloride and propargylamine were used successively to react with polyasparamide.PSI-Phe-OMe-PA is a biocompatible functional drug carrier.

derivatives of polyasparamide; ethynylation; drug carrier; biocompatibility

國家自然科學(51473080)；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(14JCZDJC33300)；北京協和醫學院“協和青年基金”(3332015100)；國家自然科學基金 青年科學基金(51303213)；中國醫學科學院放射醫學研究所基金(所探1550)

高紅林，女，碩士，研究方向：藥物載體材料的設計及生物性能研究，E-mail:mwtghl@163.com；宋娜玲，通訊作者，女，副研究員，碩士生導師，研究方向：蛋白質分析和核酸分析的新技術、新方法和新試劑的研究以及生物醫用材料的設計等，E-mail：nalingsong@sina.com；王燕銘，共同通訊作者，男，博士，副教授，研究方向：功能性高分子材料和雜化材料的化學生物學性質以及藥物和基因控釋研究，E-mail：wangyanming@nankai.edu.cn。

R914.5

A

1005-1678(2015)09-0001-04