人參皂苷納米乳的美白抗衰作用及其安全性評價

賈越光，丁志英，肖嘉婧 ，張新然，3， 池季洪 ，孫波Δ

(1.一汽總醫院 藥學部，吉林 長春 130011；2.吉林大學 藥學院，吉林 長春 130021；3.北京大學醫學部 藥學院，北京 100191)

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人參皂苷納米乳的美白抗衰作用及其安全性評價

賈越光1，丁志英2?，肖嘉婧2，張新然2，3， 池季洪2，孫波2Δ

(1.一汽總醫院 藥學部，吉林 長春 130011；2.吉林大學 藥學院，吉林 長春 130021；3.北京大學醫學部 藥學院，北京 100191)

目的 研究人參皂苷納米乳的美白抗衰作用及其安全性。方法 美白作用: 用維生素C為對照藥品，測定酪氨酸酶抑制率。抗衰老作用：建立D-半乳糖大鼠衰老模型，在大鼠頸背部皮膚上涂抹人參皂苷納米乳及對照藥品，每日2次，制備涂片，比較皮膚組織纖維的排列變化，測定DPPH自由基清除率。安全性評價：觀察皮膚涂抹人參皂苷納米乳及對照藥品后，不同時間的皮膚變化情況。結果 人參皂苷濃度為7.00 mg/mL時，酪氨酸酶抑制率順序是，維生素C水溶液>人參皂苷納米乳>人參皂苷水溶液；在衰老大鼠皮膚上涂抹人參皂苷納米乳，切片結果顯示，彈力纖維與皮膚表面較為平行，而未涂抹的對照組，彈力纖維排列較為曲折，與皮膚表面不平行；DPPH自由基清除率結果顯示， 維生素C水溶液>人參皂苷納米乳>人參皂苷水溶液，且隨著人參皂苷載藥量的增大，人參皂苷納米乳清除DPPH自由基的效率明顯上升；安全性結果顯示，皮膚涂抹人參皂苷納米乳后，沒有紅腫、刺激等現象發生。結論 人參皂苷納米乳比人參皂苷水溶液具有更明顯的美白抗衰作用，沒有刺激，不會對皮膚造成損傷，安全可靠。

人參皂苷；納米乳；抗衰老；美白；安全性

傳統中藥人參Ginseng Radix et Rhizoma 系五加科人參屬植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根莖，“味甘，微寒，主補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智，久服輕身延年”[1]。始載于我國歷史上第一部記載藥物的著作《神農本草經》，列為上品。

人參的特征性化學成分主要為人參皂苷(ginsenoside)[2-3]，具有改善記憶障礙、延緩衰老、提高免疫功能、抗氧化、 改善心血管系統功能、抗應激、壯陽等作用，一直是國內外醫藥領域的研究熱點[3-6]。人參皂苷既可抑制自由基的產生， 也可直接對抗自由基對組織及細胞的損傷作用， 或直接清除自由基， 還可增強機體本身抗氧化系統的功能，從多個環節阻斷自由基的損傷作用[7]。人參通過提高體內及皮膚表皮細胞內超氧化物歧化酶的活性，來加強活性氧化自由基的消除，阻止體內有害物質的產生，改善機體的代謝，減少或消除已經產生并積滯于體內的脂褐質[5]。人參還具有抗紫外線護膚的功能。其中人參皂苷是一種生理活性物質，具有護膚、抗紫外線功能。是高檔化妝品的天然添加物，對婦女雀斑、褐斑、蝴蝶斑及老年皮膚色素沉著療效顯著[8-9]。

納米乳是指由油、水、乳化劑和助乳化劑形成的粒徑小于100 nm，外觀澄清透明的熱力學穩定體系。經皮給藥具有避免引發胃腸道刺激、肝臟首過效應及患者可接受性強等特點，納米乳由水相、油相、表面活性劑(S)和助表面活性劑(COS)四種成份組成，除了具有穩定性好、制備簡單、粒徑小(僅為10～100 nm)等優點外，相關研究顯示納米乳具有獨特的經皮機理和特性，納米乳的表觀透皮系數Kp值分別是凝膠的2.4 倍及酊劑的3.2 倍[10]。納米乳具有透皮促進滲透作用，可增加藥物的透皮吸收量[11]。研制人參皂苷納米乳，研究其對皮膚的美白抗衰作用和安全性，為人參皂苷納米乳經皮吸收的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：Wistar大鼠30只(吉林大學實驗動物中心，SCKK-(吉)-2007-0003)，平均體重(120g±5)g。

1.1.3 主要儀器：HJ-6A多頭磁力加熱攪拌器(常州國華電器有限公司)；BSA124S電子天平(德國sartorius科學儀器有限公司)；Nano-ZS粒度測定儀(馬爾文公司)；WFV UV-2100紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京市醫療設備廠)；RM2245切片機(Leica)；BMJ-1生物組織包埋機(天津航空機電公司)；202-OA型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ5200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液配置：酪氨酸酶溶液：稱取500 U/mg的酪氨酸酶，用PBS溶液配制成100 U/mg的酶液，冷凍保存。

L-酪氨酸溶液：稱取L-酪氨酸與PBS緩沖液配制成0.05%的溶液。

人參皂苷納米乳：取處方量的大豆卵磷脂、Labrasal、1，2-丙二醇和IPM混勻，攪拌下緩慢滴加蒸餾水，再加入處方量的人參皂苷，攪拌至溶解[12]，得澄清透明淡黃色人參皂苷納米乳，測定粒徑和電位，鑒定納米乳的類型。

人參皂苷水溶液：將人參皂苷加入蒸餾水中，攪拌直至溶解，載藥量與人參皂苷納米乳相同。

VC溶液：將VC溶于蒸餾水中，制成與納米乳載藥量相等的溶液。

D-半乳糖溶液：取D-半乳糖用生理鹽水，配置成1 g/100 mL濃度的D-半乳糖溶液。

政策四：7月4日，國家市場監管總局、農業農村部、國家衛生健康委員會三部門聯合發布《關于加強食用植物油標識管理的公告》，明確提出轉基因食用植物油應當按照規定在標簽、說明書上顯著標示。對我國未批準進口用作加工原料且未批準在國內商業化種植，市場上并不存在該種轉基因作物及其加工品的，食用植物油標簽、說明書不得標注“非轉基因”字樣。

DPPH自由基溶液：量取DPPH，用無水乙醇配置成濃度為0.04 g/L的溶液，冷藏。

1.2.2 酪氨酸酶抑制試驗:按表1配制好反應組T1、T2、C1、C2置于EP管中，混合均勻，置37 ℃恒溫水浴鍋內，保持反應10 min，向各個管中加入L-酪氨酸溶液1 mL，混合均勻，再置于37 ℃恒溫水浴鍋內，保持反應4分鐘，迅速放入比色皿中，于第5分鐘在475 nm處測得吸光度AT1、AT2、AC1、AC2，根據抑制率公式，計算人參皂苷納米乳、空白納米乳、人參皂苷水溶液、VC溶液作為供試藥液，對酪氨酸酶的抑制率[13]。

抑制率表1 酪氨酸酶抑制實驗試劑配比表Tab.1 Tyrosinase inhibition test kit

1.2.3 大鼠抗衰老實驗:將30只大鼠隨機分為6組，剔去背部皮膚的毛，在頸背部取2 cm×2 cm的部位剃毛，每天早晚各涂抹一次實驗藥品，每次0.5 mL。①組涂抹人參皂苷納米乳，注射D-半乳和糖溶液；②組涂抹人參皂苷納米乳，注射生理鹽水；③組涂抹人參皂苷水溶液，注射D-半乳糖溶液；④組涂抹人參皂苷水溶液，注射生理鹽水；⑤組涂抹空白納米乳，注射D-半乳糖溶液；⑥組涂抹空白納米乳，注射生理鹽水。①③⑤每天注射一次配置好的1%的D-半乳糖溶液50 mg/kg，約0.5 mL。②④⑥每天注射一次等量的生理鹽水。涂抹1 h、24 h和48 h及20天觀察皮膚涂抹部位反應和變化。

1.2.4 切片制備及染色:處死大鼠，取涂抹藥物的實驗組皮膚和未涂抹藥物的對照組相同位置皮膚，按以下步驟制備切片和染色：① 10%的甲醛溶液固定；②用水沖洗；③用不同濃度的酒精脫水；④用無水乙醇和二甲苯使切片透明；⑤用石蠟進行進蠟和包埋；⑥切片；⑦展開；⑧烘干；⑨用蘇木精、伊紅、二甲苯、無水乙醇等進行染色；⑩用樹膠封片[14]。之后在顯微鏡下觀察彈力纖維和膠原纖維的排列情況。

1.2.5 DPPH自由基清除試驗:首先將制備的人參皂苷納米乳以及相同載藥量的人參皂苷水溶液和VC溶液進行稀釋，濃度分布為1.80 mg/mL、3.57 mg/mL、7.00 mg/mL、13.48 mg/mL作為對照組。

取DPPH自由基溶液和乙醇各2 ml置于同一EP管中，混合均勻避光放置30 min，于517 nm測得吸光度Ac；另稱取DPPH自由基溶液和人參皂苷納米乳各2 mL置于同一EP管中，混合均勻避光放置30 min，于517 nm測得吸光度Ai；稱取乙醇溶液和人參皂苷納米乳各2 mL置于同一EP管中，混合均勻避光放置30 min，于517 nm測得吸光度Aj[15]。平行測三組數據，根據以下公式計算人參皂苷納米乳、人參皂苷水溶液和空白納米乳對DPPH自由基的清除率。

2 結果

2.1 人參皂苷納米乳的粒徑、zeta電位及結構類型 人參皂苷納米乳(載藥量為3.5%)平均粒徑39.53，分布范圍窄，粒徑較均勻，PdI為0.789。見圖1。

圖1 人參皂苷納米乳粒徑Fig.1 The size of ginseng saponins nano

人參皂苷納米乳的zeta電位為-0.368 mV。見圖2。

圖2 人參皂苷納米乳zeta電位Fig.2 The zeta electric potential of ginseng saponins nano

納米乳中滴加了水溶性染料亞甲藍后，迅速擴散，表明人參皂苷納米乳為水包油(O/W)型。見圖3。納米乳中滴加了脂溶性染料蘇丹紅Ⅲ后，不擴散，表明人參皂苷納米乳為水包油(O/W)型。見圖4。

圖3 亞甲藍染色Fig.3 Methylene blue staining

圖4 蘇丹紅Ⅲ染色Fig.4 Tonyred Ⅲstaining

2.2 酪氨酸酶抑制試驗 人參皂苷納米乳及對照品的酪氨酸酶抑制率，在人參皂苷濃度為7.00 mg/mL時，抑制率順序為：維生素C>人參皂苷納米乳>人參皂苷水溶液；而在實驗的其它濃度時，抑制率順序為：維生素C>人參皂苷水溶液>人參皂苷納米乳；表明人參皂苷納米乳的美白作用與濃度密切相關。見表2。

表2 不同藥物對酪氨酸酶的抑制率Tab.2 Inhibitory rate of different drugs on tyrosinase

人參皂苷納米乳的酪氨酸酶抑制率曲線，結果顯示，抑制率隨人參皂苷濃度不同而改變，其中，人參皂苷濃度為7.00 mg/mL時，抑制率達到最大值64%，遠高于人參皂苷水溶液9%。見圖5。

圖5 人參皂苷納米乳酪氨酸酶抑制率結果Fig.5 Inhibition rate ginsenoside nanometer cheese

2.3 皮膚切片中纖維排列變化 涂抹人參皂苷納米乳(載藥量約為3.5%)后，皮膚彈力纖維和膠原纖維排列規則，而且與皮膚表面較為平行，表明人參皂苷納米乳具有抗皮膚衰老作用；而對照組的彈力纖維和膠原纖維排列紊亂，纖維走向不再平行于表皮，不利于承受來自外界的張力，表現出皮膚衰老狀態。見圖6、7。

圖6 涂抹人參皂苷納米乳組(HE染色法×400)Fig.6 experimental group(HE staining×400)

圖7 對照組(HE染色法×400)Fig.7 matched group(HE staining×400)

2.4 自由基清除試驗 DPPH自由基清除實驗結果見圖8和圖9及表3所示。其中圖8表明，人參皂苷納米乳對DPPH自由基的清除效果要優于人參皂苷水溶液，但不如VC水溶液，說明人參皂苷納米乳具有明顯的抗衰老作用。

圖8 DPPH自由基清除率結果(未稀釋)Fig.8 DPPH free radicalscavenging rate(no dilute)

圖9表明，人參皂苷納米乳隨著濃度的增加，清除自由基的能力增強，當濃度達到13.48 mg/mL時，人參皂苷納米乳的自由基清除能力與陽性對照VC水溶液相當。實驗中，還對比了人參皂苷水溶液，結果沒有規律，有待繼續深入研究。

圖9 DPPH自由基清除率結果Fig.9 DPPH free radicalscavenging rate

濃度(mg/mL)納米乳水溶液維生素C3.5%(182)88.7358.5994.491.833.45—95.923.5736.10—73.627.0050.44—93.9813.4880.00—80.88

2.5 皮膚安全性評價 皮膚涂抹人參皂苷納米乳后，不同時間觀察皮膚均沒有任何紅斑、水腫、潰瘍或出血等變化，表明人參皂苷納米乳對皮膚沒有刺激性和損傷。

3 討論

人參皂苷納米乳具有美白和抗衰老作用，在濃度為7.00 mg/mL時，人參皂苷納米乳比人參皂苷水溶液作用更強，且對無皮膚刺性和損傷，安全可靠。

預實驗測得較高濃度的人參皂苷納米乳和極低濃度的人參皂苷納米乳對酪氨酸酶沒有抑制作用。因此，選用濃度分別為1.80 mg/mL、3.57 mg/mL、7.00 mg/mL、13.48 mg/mL的人參皂苷納米乳以及相同濃度的人參皂苷水溶液和維生素C水溶液進行實驗研究，結果在濃度為7.00 mg/mL時，人參皂苷納米乳比人參皂苷水溶液作用更強。文獻[16]研究認為人參皂苷Rb1 濃度<50 μg/mL對黑色素細胞的生長增殖沒有影響。文獻[17]研究表明，Rb1 在小劑量時B16黑色素細胞增殖有促進作用， 大劑量時對B16黑色素細胞增殖有抑制作用，而對體外酪氨酸酶活性無影響，這些結果與本實驗研究結果相同，說明人參皂苷的美白功效并不是用量越多越好，且本實驗研制的人參皂苷納米乳載藥量也在文獻報道的美白濃度范圍內一致。實驗結果中人參皂苷納米乳也是能改變皮膚中彈力纖維膠原纖維，發揮抗衰老作用與人參皂苷通過提高抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活力，增加皮膚中彈力纖維膠原纖維含量，抑制人角質形成細胞凋亡，最終發揮抗皮膚衰老作用[15]的結論一致。

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(編校：譚玲)

Whitening and anti-aging effect of ginseng saponin nano and its safety evaluation

JIA Yue-guang1, DING Zhi-ying2?, XIAO Jia-jing2, ZHANG Xin-ran2,3, CHI Ji-hong2, SUN Bo2Δ

(1.Department of Pharmacy, General Hospital, Fourth Hospital of Jilin University, Changchun 130011, China; 2.School of Pharmacy, Jilin University, Changchun 130021, China; 3.School of Pharmacy, Peking University Health Science Center, Beijing 100191, China)

ObjectiveTo study on whitening and anti - aging effect of ginseng saponin and its safety.MethodsWhitening effect: using vitamin C as the control drug, the inhibition rate of tyrosinase was determined.Anti senescence effect: the aging model of D- was established, and the DPPH was applied to the skin of the rat's neck, and the drug was prepared by 2 times a day.Skin safety evaluation: the skin changes of the skin of the ginseng saponins were observed after the skin was given ginseng saponin and control drugs.ResultsWhen the concentration of ginsenoside was 7 mg/mL, the inhibition rate order was, the water solution of vitamin C>ginsenoside nano >ginsenoside aqueous solution ; In the aging model, the surface of the elastic fibers and the skin surface was parallel to the skin, but the elastic fibers were arranged in a more tortuous and non parallel to the skin; DPPH free radical scavenging effect order was, Vitamin C aqueous solution>ginsenoside nano>ginsenoside aqueous solution, and with the dosage of ginsenoside increasing, the efficiency of ginsenoside DPPH scavenging free radical increased significantly; Skin safety evaluation results showed that ginseng saponin nanometer milk smeared skin, no redness, irritation and other phenomena occured.ConclusionGinseng saponin nanometer milk has obvious whitening effect, and can not cause damage to the skin, is safe and reliable.

ginsenoside; nano emulsion; anti-aging;whitening; security

吉林省科技發展計劃項目(20110919)

賈越光，女，本科，副主任藥師，研究方向：新藥研究，E-mail： yqzyyjyg@.163.com；丁志英，共同第一作者，女，博士，博士生導師，研究方向：納米載藥系統經皮吸收研究，生物藥劑學與藥物動力學研究，臨床藥學研究，E-mail：dzy@jlu.edu.cn；孫波，男，通訊作者，本科，高級工程師，研究方向：實驗病理學，E-mail： zbr@jlu.edu.cn。

R283

A

1005-1678(2015)09-0019-04