鹿茸蛋白2種不同提取方法的比較研究

李超華，王毅，何忠梅，孫婭楠

(1.吉林農業大學 中藥材學院，吉林 長春 130118；2.中國中醫科學院 醫學實驗中心 形態學實驗室， 北京 100700)

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鹿茸蛋白2種不同提取方法的比較研究

李超華1,2，王毅2，何忠梅1Δ?，孫婭楠2Δ?

(1.吉林農業大學 中藥材學院，吉林 長春 130118；2.中國中醫科學院 醫學實驗中心 形態學實驗室， 北京 100700)

目的 探討從鹿茸中獲得促進神經細胞損傷修復蛋白的最佳提取方法。方法 將新鮮鹿茸分別采用勻漿法和超微粉碎法獲取鹿茸蛋白混合物(velvet antler proteins, VAPs)；用Bradford法及SDS-PAGE檢測并比較蛋白含量及蛋白組分差別；用掃描電鏡觀察不同提取方法超微結構不同。建立1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)MPP+誘導神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y損傷模型，用該模型觀察不同提取方法所得蛋白對損傷恢復的影響。結果 超微粉碎法提取的鹿茸蛋白得率更高，得到的蛋白質條帶更多，圖譜清晰；電鏡結果表明超微粉碎法得到的鹿茸蛋白干粉均無細胞結構，且顆粒較細；活性檢測中，勻漿法提取的鹿茸蛋白從125 μg/mL 濃度開始可顯著提高1mM MPP+作用下 SH-SY5Y 細胞的增殖率，而超微粉碎法提取的鹿茸蛋白的最低有效濃度為62.5 μg/mL，促增殖率可達到25.45%。結論 超微粉碎法既能大量提取鹿茸蛋白又能最大限度保證蛋白促細胞增殖活性，是較為理想的蛋白提取方式。

鹿茸；蛋白提取；SH-SY5Y

鹿茸為鹿科動物梅花鹿或馬鹿的密生茸毛的未骨化的幼角，是我國非常珍貴的傳統中藥材。研究表明，鹿茸中的化學成份較復雜，其主要的藥理活性成分有無機元素、氨基酸、多肽、蛋白質、多糖、脂肪酸、磷脂等，其中蛋白類成份高達55.26%[1]。

近年來一系列相關研究[2-5]發現：鹿茸蛋白具有免疫調節、促進創傷愈合、改善性功能、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗疲勞、抗缺氧、治療神經損傷等多種生物學效應，有廣泛的應用前景和巨大的藥用價值。因此如何得到大量蛋白質并保證其蛋白活性是闡釋其藥理作用的前提。

本研究對2種不同提取方法即勻漿法和超微粉碎法對鹿茸蛋白提取含量及產率的影響進行了比較分析，并探討了2種方法提取的蛋白促MPP+損傷后SH-SY5Y細胞增殖的活性，為后續藥效學研究篩選出鹿茸蛋白提取的最佳方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑：SH-SY5Y細胞株由西苑醫院贈送；Bradford蛋白定量試劑盒為天根生化公司產品(Lot No. PA102)；考馬斯亮藍(Amresco公司)；EDTA、TEMED(Sigma公司)；過硫酸銨、冰乙酸、甲醇購自國藥集團化學試劑有限公司；噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自Amresco公司；胎牛血清FBS(Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(Sigma公司)。

1.1.2 實驗儀器：膠體磨(Lot No. KJM-50S，北京錕杰玉誠機械有限公司)；旋轉蒸發儀(BUCHI瑞士)；高速冷凍離心機(GL-20G-H，上海安亭科學儀器廠)；垂直電泳儀(Bio-Rad美國)；G-Box凝膠成像系統(美國基因公司)；掃描電子顯微鏡(S-3400N日本日立公司)；酶標儀(Bio-Rad美國)。

1.2 方法

1.2.1 鹿茸蛋白提取方法

① 勻漿法提取鹿茸蛋白：將切成小塊狀的鮮鹿茸先用中藥粉碎機粉碎成碎末，然后將粉碎的鹿茸在自來水下浸泡沖洗至無血色。取200 g鹿茸肉末浸泡于預冷至4 ℃的2 000 mL純水溶液中，膠體磨勻漿8～10 h，每2小時旋轉膠體磨一次減小粒徑，以充分破碎細胞。勻漿結束后加入一定量的冰醋酸保持pH4于4 ℃過夜，5 000 r/min離心10 min分離上層清夜，收集上層清液于1 Kd透析袋用自來水透析脫鹽，每4 h更換一次透析液，直至經pH試紙測量外部透析液為中性后，結束透析。透析袋內所得液體即為鹿茸蛋白溶液。將鹿茸蛋白溶液于55 ℃以下進行旋轉蒸發濃縮至200 mL以內，5 000 r/min離心10 min除掉沉淀之后，冷凍干燥，稱量干燥后粉末重量計算產率，4 ℃保存。

② 超微粉碎法提取鹿茸蛋白：鮮鹿茸先用粉碎機破碎成小塊，然后液氮速凍后置入超微粉碎機中粉碎至肉糜狀，粒徑75 μm左右，200目以上。稱取200 g鹿茸糜狀物按照1:10(W/V)的比例加入水及適量的冰醋酸保持pH 4置于4 ℃過夜，3 000 r/min離心10 min分離上層清夜，將上層清液于1 Kd透析袋用自來水透析脫鹽，每4 h更換一次透析液，直至經pH試紙測量外部透析液為中性后，結束透析。透析袋內所得即為鹿茸蛋白溶液。將鹿茸蛋白溶液55 ℃以下旋轉蒸發濃縮至200 mL以內，冷凍干燥，稱量干燥后粉末重量計算產率，4 ℃保存。

1.2.2 總蛋白含量的測定：參照Bradford(1976)[6]方法檢測蛋白含量。按蛋白含量測定試劑盒要求操作，溶液樣品與考馬斯亮藍溶液反應8 min后于595 nm測吸光度。根據繪制的標準曲線，計算鹿茸提取物蛋白含量。

考馬斯亮藍染液在使用前應平衡溫度至室溫并溫和顛倒混勻，將蛋白標準品(BSA)標準溶液(1 mg/mL)標準品按0 μL，1 μL，2 μL，3 μL，4 μL，5 μL，6 μL的體積加到96孔板的標準品孔中，再加入PBS補足到10 μL，向孔中加入190 μL考馬斯亮藍染液，混勻，室溫放置8 min。用酶標儀測定595 nm處的OD值。

1.2.3 SDS-PAGE電泳：配置10%分離膠和5%濃縮膠，樣品上樣量為20 μL。上樣前12 000 r/min離心1 min。初始電壓80 V，當溴酚藍進入分離膠時電壓設置為120 V，電泳后進行考馬斯亮藍染色45 min(染色液：0.25 g考馬斯亮藍+50 mL甲醇+7 mL冰乙酸+蒸餾水至100 mL)及脫色過夜(脫色液：10 mL甲醇+10 mL冰乙酸+蒸餾水至100 mL)。

1.2.4 掃描電鏡檢測：將鹿茸蛋白提取物干粉用導電雙面膠粘在樣品臺上，噴金(60 s)，用掃描電鏡觀察(×200，局部放大至×800，電壓10 kV)。

1.2.5 SH-SY5Y細胞培養:液氮中取出凍存的細胞株，復蘇培養，用DMEM完全培養基(含10% FBS，100 U/mL青霉素、鏈霉素，pH 7.4)培養，置37 ℃，5%CO2，95%濕度培養箱中培養，細胞為單細胞貼壁生長，當細胞貼壁數大于85%時(對數生長期)可傳代培養。

1.2.6 MTT法檢測鹿茸促細胞增殖作用:取對數生長期的 SH-SY5Y 細胞，以相同濃度的細胞接種于 96 孔板，待細胞貼壁。細胞貼壁后模型組以 1 000 μM MPP+作用于 SH-SY5Y 細胞。治療組分別以15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL的8個不同濃度的2種鹿茸蛋白和 MPP+作用于SH-SY5Y細胞。對照組只加 SH-SY5Y 細胞，不加藥物，分別檢測不同方法提取的鹿茸蛋白對MPP+損傷48 h的SH-SY5Y細胞的保護作用。細胞給藥時間結束前4 h，每孔加 20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液。繼續培養4 h后棄去培養液，每孔加入200 μL DMSO，震蕩 2 min 后于酶標儀 490 nm 處檢測吸光度值(A)。增值率=(OD給藥-OD模型)/(OD正常-OD模型)×100%。

2 結果

2.1 蛋白質的提取方法比較 每250 g鮮鹿茸用2種方法可分別提取蛋白3.11 g(勻漿法)和6.21 g(超微粉碎法)，勻漿法提取的鹿茸純蛋白產率最高為0.08%，超微粉碎法提取的鹿茸純蛋白產率最高為0.37%。對不同方法提取的總蛋白進行凝膠電泳結果如圖1所示，發現勻漿法和超微粉碎法提取的蛋白質在蛋白凝膠電泳中有明顯差別。勻漿法提取蛋白條帶清晰度比較好；超微粉碎提取法不僅含有較多大分子蛋白也含有較多小分子蛋白，與勻漿法相比在35 kD左右多出一條蛋白條帶，且在55 kD與250 kD附近蛋白含量較多。

表1 不同提取方法獲得梅花鹿鹿茸蛋白含量(g/250 g鮮鹿茸)Tab.1 Protein content of VAPs by two different methods (g/250 g flesh VA)

圖1 不同提取方法所提取的鹿茸蛋白質SDS-PAGE圖譜的比較1：marker；2、3：勻漿法；4、5：超微粉碎法Fig.1 Extracted by different extraction methods of velvet antler proteins sds-page map comparison1:maker; 2: homogenization; 3:micronization

2.2 鹿茸凍干粉的電鏡檢測 圖2A所示，放大200倍后可見超微粉碎法得到的鹿茸干粉的結晶物表面光滑，局部放大800倍后仍未見明顯顆粒。圖2B所示，勻漿法得到的鹿茸干粉放大200倍后可見部分顆粒，局部放大800倍后顆粒呈圓形光滑，可能為未完全磨碎的細胞。表明超微粉碎法得到的蛋白干粉較細，細胞均已破壁。

圖2 鹿茸凍干粉的電鏡檢測分析Fig.2 Electron microscopy analysis of antler freeze-dried powder

2.3 不同方法提取鹿茸蛋白對MPP+急性損傷SH-SY5Y細胞的保護作用比較 當鹿茸蛋白與 MPP+共孵育 48 h后，采用勻漿法提取的鹿茸蛋白從125 μg/mL濃度開始可顯著提高1mM MPP+作用下SH-SY5Y 細胞的增殖率，而超微粉碎法提取的鹿茸蛋白的最低有效濃度為62.5 μg/mL，增殖率可達到25.45%。見表1。

表2 不同提取方法提取鹿茸蛋白對MPP+損傷SH-SY5Y細胞 的保護作用比較 (n=5)Tab.2 The protective effect of different extraction methods of VAPs against MPP+-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cell line(n=5)

*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

3 結論

鹿茸始載于漢代的《神農本草經》，具有“生精補髓，養血益陽，強筋健骨，治一切虛損、耳聾、目暗、眩暈虛痢”。鹿茸的再生、迅速增長是依賴于一系列內在激素和生長因子，現代藥理學研究表明鹿茸的主要有效活性成分應為鹿茸中大量存在的蛋白類物質[7]。因此如何獲得大量的鹿茸蛋白并保證其蛋白活性是確定其藥理學作用的基礎步驟，也是蛋白質組學研究中重要的一環[8]。

目前常用的蛋白提取方法主要有有機溶劑提取法、裂解液法、酶法、超聲波萃取法、雙水相萃取法和超臨界萃取法等。其中，有機溶劑容易引起蛋白質變性失活，在提取蛋白質時比較少用。裂解液法提取蛋白的步驟相對較多、耗時長，可能引起蛋白的降解，同時裂解液法中所用到的助溶劑中的幾種成分有細胞毒性，而除雜過程中用到的丙酮有劇毒，不適用于后續的動物和細胞實驗[9-10]。雙水相萃取法價格昂貴，限制了其在工業中大規模的應用；體系本身易乳化，使得萃取過程極不穩定；某些高聚合物雙水相體系分相時間較長，大大降低了生產效率[11]。超臨界萃取法所需設備昂貴，成本高。相比較而言，勻漿法和超微粉碎法提取工藝簡單，步驟少，成本低，對活性無影響。

本研究采用勻漿法和超微粉碎法2種提取方法對鹿茸蛋白的提取方法進行比較發現，超微粉碎法提取的純蛋白產率和含量均高于勻漿法。就蛋白電泳圖可見超微粉碎法蛋白條帶較多，且蛋白條帶較粗。

2種提取方法中勻漿法是在酸性體系中提取鹿茸蛋白，所獲得的鹿茸蛋白因為要保持其在溶液中的溶解度，使得體系中含鹽量高，電泳條件不穩定，不利于電泳條帶的觀察。超微粉碎法步驟簡單，無需特別前處理，產率較高，所得到的蛋白種類多，蛋白含量大，條帶清晰、明確，且不改變蛋白結構，對活性無影響。電鏡結果也顯示超微粉碎法提取的鹿茸蛋白凍干粉已無細胞結構，且顆粒較細。因此，超微粉碎法能夠獲得大量鹿茸蛋白更適于后續對鹿茸蛋白藥效學的研究。

運用MPP+誘導的急性損傷SH-SY5Y模型對2種方法提取的鹿茸蛋白活性的比較分析結果也表明，超微粉碎法提取的鹿茸蛋白具有較高的活性，其促進MPP+損傷后的SH-SY5Y細胞增殖率明顯高于勻漿法，且最小有效濃度為62.5 μg/mL，低于勻漿法的125 μg/mL。

綜上所述，在現有的研究階段，由于口服鹿茸中發揮藥效作用的活性成分和種類尚不明確，且蛋白類物質容易變性失活，為保證實驗的可重復性和準確性，同時保證工作的高效進行，采用既能大量提取蛋白又能保證蛋白活性的超微粉碎法是較為理想的提取方式。

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[5] 段冷昕，李夏，王楠婭.鹿茸多肽促進肝細胞增殖及肝部分切除小鼠的肝再生[J].中國藥學雜志，2008，43(1)：27-30.

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(編校：譚玲)

Comparison of two protein extraction methods from velvetantler

LI Chao-hua1,2, WANG Yi2, HE Zhong-mei1Δ?， SUN Ya-nan2Δ?

(1.College of Chinese Medicine Materials, Jilin Agriculture University, Changchun 130118, China; 2.Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medicine Science, Beijing 100700, China)

ObjectiveTo compare optimal protein extraction method of velvet antler(VA) and explore the repairmen activity of velvet antler proteins (VAPs) on 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) damaged nerve cell. MethodsVAPs was obtained from fresh velvet antler by homogenization and micronization method respectively. The protein content of VAPs was measured by Bradford and the molecular weight was identified by SDS-PAGE. Scanning electron microscope (SEM) was perfomed to observe the ultrastructure of VAPs. Neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) damage was induced by MPP+, and activity of each compound was compared by the proliferation of damaged cell detected by MTT method. ResultsThe yield of micronization method of VAPs was higher than homogenization method and with better characters both in SDS-PAGE and SEM. Activity detection indicated that VAPs at the concentration of 125 μg/mL by homogenate method could significantly increase the proliferation rate of damaged SH-SY5Y cells. By contrast, VAPs by micronization method had more effective effect at 62.5μg/mL, and proliferation rate could reach 25.45%. ConclusionMicronization method does not only acquire more protein but also has cell proliferation activity, is a relatively ideal way of protein extraction of velvet antler.

velvet antler; protein extraction; SH-SY5Y

國家自然科學基金(81373884)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項基金(ZZ2013005，ZZ0808011)

李超華，女，碩士在讀，研究方向：生藥學，E-mail：928191089@qq.com；何忠梅，通訊作者，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：中藥有效成分及作用機理研究，E-mail：435398002@qq.com；孫婭楠，共同通訊作者，女，博士，助理研究員，研究方向：生物光子學在中醫藥研究領域的應用，E-mail：23731787@qq.com。

R9

A

1005-1678(2015)09-0023-03