大黃素體外對小鼠免疫細胞的影響及其溶血作用

田一含，喬瑞紅，謝鯤鵬，謝明杰

(遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧省生物技術與分子藥物研發重點實驗室，遼寧 大連 116081)

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大黃素體外對小鼠免疫細胞的影響及其溶血作用

田一含，喬瑞紅，謝鯤鵬，謝明杰Δ

(遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧省生物技術與分子藥物研發重點實驗室，遼寧 大連 116081)

目的 探討大黃素對小鼠免疫功能的影響及其溶血毒性。方法 制備并體外培養小鼠特異性免疫細胞T、B淋巴細胞及非特異性免疫細胞巨噬細胞、NK細胞，采用濃度為5、10、15、20 μM的大黃素分別處理各免疫細胞，另設DMSO為對照組，采用中性紅法和MTT法檢測大黃素對免疫細胞功能的影響。采用濃度為20、40、60、80 μM的大黃素進行體外溶血實驗，以生理鹽水為空白對照組，以無菌蒸餾水為陽性對照組，觀察大黃素的溶血毒性。結果 與對照組比較，5、10、15、20 μM組對T、B淋巴細胞增殖的影響差異均不具有統計學意義(F=0.009，P=1.000；F=0.003，P=1.000)，各劑量組提高巨噬細胞吞噬能力且呈濃度依賴性(F=665.525，P=0.000)，提高巨噬細胞增殖率且呈濃度依賴性(F=134.812，P=0.000)，提高NK細胞活性且呈濃度依賴性(F=200.190，P=0.000)。溶血實驗結果顯示，大黃素在20～80 μM濃度范圍內，溶血率測定結果均小于5%。結論 大黃素能顯著促進小鼠非特異性免疫細胞的活性，在大黃素發揮有效活性的濃度范圍內，對紅細胞無溶血毒性。

大黃素；特異性免疫細胞；非特異性免疫細胞；體外；溶血毒性

免疫功能是人體及其重要的自衛功能，能抵御各種疾病的發生和發展，因此獲得具有提高機體自身免疫系統的藥物，是最終治愈疾病的有效方法[1]。長期以來，中藥以其較好的生物活性，較低的毒副作用和具有提高機體免疫活性等作用，成為各國學者獲取有效藥物的主要來源[2]。已有研究表明，革皮氏海參皂苷、藏藥綠蘿花水提物、樟芝多糖、茵陳蒿等中藥提取物都可以提高機體免疫活性[3-6]。大黃素(emodin，EM)主要來源于蓼科植物虎杖和掌葉大黃的根莖和根中[7-8]。近年來的研究發現，大黃素具有廣泛的藥理學功效，包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎和抑菌等活性[9]。本實驗室前期對大黃素的抗腫瘤作用和抑菌作用進行了深入的研究，抗腫瘤實驗結果顯示，大黃素可通過干預ERα-MAPK/Akt-cyclin D1/Bcl-2信號轉導途徑來抑制乳腺癌細胞的增殖[10]。抑菌實驗結果顯示，大黃素對金黃色葡萄球菌的抑制作用主要是通過對其細胞膜通透性的破壞、菌體內蛋白質的合成及代謝關鍵酶活性的抑制等多種途徑來實現[11]。但目前關于大黃素對免疫的調節作用研究較少，因此，本文對大黃素體外對小鼠免疫細胞的影響及其溶血作用進行了研究，旨在為研究大黃素的藥理作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞：K562細胞由中國醫學科學院基礎研究所細胞中心提供；

動物：雄性的ICR小鼠(SPF級)1只，5周齡，體質量20 g，由大連醫科大學提供，合格證號：SCXK Liao 2008-0002；

試劑：大黃素(純度≥98%)購于中國食品藥品檢定研究院；新生牛血清購于Gibco公司；DMSO、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、RPMI-1640購于Sigma公司；PBS緩沖液、紅細胞裂解液、中性紅、D-Hank’s液、BSA購于上海生工生物工程有限公司；尼龍毛柱購于伊普瑞斯科技有限公司。人的新鮮血液由大連市紅十字血液中心提供。

儀器：Multican Ascent酶標儀型(Thermo公司)；UV1102型紫外分光光度計(上海天美科技儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大黃素對小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響：① 小鼠T、B淋巴細胞分離：小鼠T、B淋巴細胞分離參照高巍等[12]的尼龍毛柱法：脫頸處死小鼠，取出脾臟，研磨，離心，去上清，加入紅細胞裂解液室溫靜置5 min。用培養液調整細胞密度為5×108個/mL，將脾細胞懸液上柱，待細胞全部滴入柱內，孵育1 h，培養液(30 mL)洗柱，流出的細胞為T淋巴細胞，柱內細胞為B淋巴細胞，分別收集，離心，含15%新生牛血清的RPMI-1640培養液重懸，備用；

② 大黃素處理小鼠T、B淋巴細胞：用含15%新生牛血清的RPMI-1640培養液調整T、B淋巴細胞密度為2×106個/mL，以每孔200 μL接種到96孔板中待細胞貼壁后，采用終濃度為5、10、15、20 μM的大黃素處理，以1‰ DMSO為對照組。于37 ℃，5% CO2培養箱中培養48 h后，每孔加入20 μL MTT，孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，酶標儀測定495 nm 下的吸光度值，每組設置3個復孔。按照下列公式計算：相對增殖率(%)=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.2.2 大黃素對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力及增殖的影響：① 制備小鼠巨噬細胞：小鼠巨噬細胞的制備參照榮岳光[13]的實驗方法：脫頸處死小鼠，于75%乙醇中浸泡5～10 min，注射5～8 mL D-Hank’s 液，將腹腔液吸到離心管中，1000 r/min離心3 min，棄上清，加紅細胞裂解液重懸，靜置3～5 min，離心，棄上清，收集細胞，15%新生牛血清RPMI-1640 培養液培養24 h，得到貼壁細胞為腹腔巨噬細胞；

② 大黃素處理小鼠巨噬細胞：調整腹腔巨噬細胞密度為 2×106個/mL。分組及處理方法同1.2.1項下②，培養48 h后，加入200 μL 0.09%的中性紅溶液孵育3 h，用PBS沖凈未被吞噬的中性紅，各孔加入200 μL細胞裂解液，室溫過夜培養，酶標儀測定495 nm下的吸光度值，每組設置3個復孔。按照下列公式計算：相對細胞吞噬率(%)=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

③ 同1.2.1項下②的方法及公式，測定巨噬細胞的相對增殖率。

1.2.3 大黃素對小鼠NK細胞活性的影響：① 制備小鼠NK細胞：制備小鼠NK細胞(脾細胞)；無菌取小鼠脾臟，剪碎、研磨、離心、洗滌后懸于含5%BSA的15%新生牛血清RPMI-1640 培養液。

② 大黃素處理小鼠NK細胞：調整效應細胞(NK細胞)密度為5×106個/mL和靶細胞(K562細胞)密度為1×105個/mL。設NK細胞組、K562細胞組及混合組(NK細胞+K562細胞)，NK細胞組、K562細胞組取相應細胞100 μL接種到96孔板中，加培養液100 μL，混合組取NK細胞、K562細胞各100 μL(50:1)，接種到96孔板中。大黃素濃度及處理方法同1.2.1項下②，培養48 h后，MTT法檢測細胞活性的方法同1.2.1項下②。按照下列公式計算NK細胞活性(%)=[1-(A混合組-ANK細胞)/AK562細胞]×100%。

1.2.4 大黃素體外溶血實驗：①制備人紅細胞：取10 mL人的新鮮血液，1000 r/min離心10 min，棄去上清液。沉淀的紅細胞再用生理鹽水洗3次，將所得紅細胞用生理鹽水配成2.0%的混懸液備用；②大黃素處理紅細胞：分別用20、40、60、80 μM大黃素處理配制好的紅細胞懸液，均勻混合后，放入37 ℃恒溫水浴孵育60 min，后1800 r/min離心10 min。取出離心管用肉眼觀察，如果細胞全部沉淀在管底，上清液為無色透明，表明未發生溶血現象，記為“-”。反之，管底只有少量或無細胞殘留，上清液為紅色，則表明發生了溶血現象，記為“+”。取上清，用紫外分光光度計測定波長540 nm下的A值，溶血率<5%，可認為未引起體外紅細胞明顯溶血。以生理鹽水為空白對照組，以無菌蒸餾水為陽性對照組，每組設3個平行復孔。按照下列公式計算溶血率：溶血率(%)=(A實驗組-A生理鹽水組)/(A蒸餾水組-A生理鹽水組)×100%。

2 結果

2.1 大黃素對T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖的影響 用0、5、10、15、20 μM濃度的大黃素處理小鼠脾臟T淋巴細胞和B淋巴細胞后，各實驗組吸光度值如下：T淋巴細胞為(1.89±0.044)、(1.894±0.044)、(1.895±0.043)、(1.896±0.044)、(1.896±0.043)(F=0.009，P=1.000)，B淋巴細胞為(1.737±0.042)、(1.739±0.042)、(1.739±0.043)、(1.74±0.043)及(1.741±0.043)。大黃素對T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖無顯著影響。小鼠脾臟T淋巴細胞和B淋巴細胞用5、10、15、20 μM濃度的大黃素處理后，與對照組相比，B淋巴細胞增殖率分別提高了(0.10±0.01)%、(0.11±0.02)%、(0.18±0.03)%和(0.21±0.09)%，T淋巴細胞增殖率分別提高了(0.23±0.03)%、(0.25±0.06)%、(0.31±0.02)%和(0.32±0.04)%。見圖1。

圖1 大黃素對T、B淋巴細胞增殖的影響(n=3)Fig.1 The effect of emodin on proliferation of T，B lymphocyte(n=3)

2.2 大黃素對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響 腹腔巨噬細胞用5、10、15、20 μM濃度的大黃素處理后，與對照組相比，吞噬能力分別提高了(56.38±4.53)%、(87.03±4.12)%、(139.46±2.87)%和(188.35±3.92)%。4個不同劑量組對巨噬細胞吞噬能力的影響差異具有統計學意義(F=665.525，P=0.000)，且呈濃度依賴性。見圖2。

圖2 大黃素對巨噬細胞吞噬能力的影響(n=3)*P<0.05，與5 μM組比較；#P<0.05，與10 μM組比較；△P<0.05，與15 μM組比較Fig.2 The effect of emodin on phagocytosis of macrophages(n=3)*P<0.05，compared with 5 μM group；#P<0.05，compared with 10 μM group；△P<0.05，compared with 15 μM group

2.3 大黃素對巨噬細胞增殖的影響 腹腔巨噬細胞用5、10、15、20 μM濃度的大黃素處理后，與對照組相比，增殖率提高了(4.82±0.37)%、(7.96±0.29)%、(13.63±0.93)%和(19.46±1.62)%。4個不同劑量組對巨噬細胞增殖率的影響差異具有統計學意義(F=134.812，P=0.000)，且呈濃度依賴性。見圖3。

圖3 大黃素對巨噬細胞代謝活性的影響(n=3)*P<0.05，與5 μM組比較；#P<0.05，與10 μM組比較；△P<0.05，與15 μM組比較Fig.3 The effect of emodin on energy metabolism of macrophages(n=3)*P<0.05，compared with 5 μM group；#P<0.05，compared with 10 μM group；△P<0.05，compared with 15 μM group

2.4 大黃素對NK細胞活性的影響 5、10、15、20 μM的大黃素作用NK細胞后，NK細胞的活性分別提高了(4.35±0.43)%、(6.59±0.92)%、(12.86±0.98)%和(21.73±1.28)%。4個不同劑量組對NK細胞活性的影響差異具有統計學意義(F=200.190，P=0.000)，且呈濃度依賴性。見圖4。

圖4 大黃素對小鼠NK細胞活性的影響(n=3)*P<0.05，與5 μM組比較；#P<0.05，與10 μM組比較；△P<0.05，與15 μM組比較Fig.4 Effect of emodin on proliferation of NK cell in mice(n=3)*P<0.05，compared with 5 μM group；#P<0.05，compared with 10 μM group；△P<0.05，compared with 15 μM group

2.5 大黃素的體外溶血實驗 溶血實驗結果顯示，大黃素在20～80 μM濃度范圍內，通過肉眼觀察無溶血現象。因為溶血率測定結果均小于5%，說明大黃素不能引起體外紅細胞溶血。見表1。

表1 大黃素體外溶血實驗結果±s，n=3)Tab.1 The hemolytic results of emodin in ±s，n=3)

3 討論

尋找生物活性高，不良反應小，且能提高機體免疫力等功效的天然藥物是當今醫學研究的熱點，機體的免疫功能對保證機體維持內環境的平衡穩定和疾病的治愈發揮著重要作用[2]。大黃素具有多種生理活性，是臨床上應用十分廣泛的藥物之一，大黃素對機體免疫細胞的調節作用，對其今后的進一步應用具有重要的影響。機體免疫包括特異性免疫與非特異性免疫，其中非特異性免疫細胞主要為巨噬細胞和NK細胞。特異性免疫細胞主要為B淋巴細胞和T淋巴細胞。巨噬細胞是機體內具有吞噬功能的一類細胞的總稱，已有的研究表明，巨噬細胞可釋放TNF-α、ROS等腫瘤殺傷分子，在調節機體免疫、吞噬和殺傷腫瘤細胞過程中發揮著重要的作用[13-14]。NK能識別并攻擊與正常細胞不同的任何膜表面發生變化的細胞，如腫瘤細胞、病毒感染細胞、較大的病原體和同種異體移植的器官、組織等[15]。本研究結果顯示，大黃素可明顯提高腹腔巨噬細胞的吞噬能力、代謝活力及NK細胞的活性，呈劑量依賴性，對機體的非特異性免疫具有促進作用。但大黃素對T淋巴細胞和B淋巴細胞的作用不明顯。

溶血實驗是研究藥物毒性必須兼顧的實驗，因為有些藥物可使機體產生溶血現象和凝聚現象，引起血液循環功能障礙，導致機體不良反應。本文的溶血實驗結果顯示，在藥物發揮有效作用的4倍濃度范圍內，溶血率均小于5%。

由于大黃素對機體免疫系統具有顯著的促進作用，使其在未來的應用中具有巨大的潛力和不可替代的優勢，但關于大黃素提高機體免疫功能的作用機制還需進一步研究。

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(編校：王儼儼)

Effect of emodin on mice immune cells and its hemolysis in vitro

TIAN Yi-han, QIAO Rui-hong, XIE Kun-peng, XIE Ming-jieΔ

(College of Life Science, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug of Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo investigate effect of emodin on mice immune function and its hemolysis toxicity.MethodsThe mouse specific immune cells of T, B lymphocytes and nonspecific immune cell of macrophages and NK cells were prepared and incubated in vitro.The different immune cells were treated by emodin with different concentrations of 5,10,15 and 20 μM, and DMSO as control group.The effect of emodin on immune cells function was detected by neutral red assay and MTT assay.The hemolysis test in vitro was conducted by emodin with different concentrations of 20, 40, 60 and 80 μM, physiological saline as blank control group and sterile distilled water as positive control group, then the hemolysis toxicity of emodin was observed.ResultsThere were no significant difference of T and B lymphocyte proliferation among control group, 5, 10, 15 and 20 μM group(F=0.009，P=1.000；F=0.003，P=1.000), the phagocytic ability of macrophages enhanced in each dose group and was concentration dependent(F=665.525，P=0.000), the proliferation rate of macrophages enhanced and was concentration dependent(F=134.812，P=0.000), the activity of NK cells enhanced and was concentration dependent(F=200.190，P=0.000).Hemolysis test results showed the hemolysis rate was less than 5% in the range of 20 to 80 μM emodin.ConclusionEmodin could significantly promote the nonspecific immune cells activity.Within the concentration of experiment, emodin has no hemolysis toxicity.

emodin; specific immune cells; nonspecific immune cell; in vitro; hemolysis toxicity

遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2013412)；大連市科技計劃項目(2013E13SF108)

田一含，女，本科，研究方向：微生物生化，E-mail：2324241060@qq.com；謝明杰，通訊作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail： xmj1222@sina.com。

Q935

A

1005-1678(2015)09-0034-04