慢病毒介導(dǎo)SiRNA沉默SGMS2基因的單克隆細(xì)胞系構(gòu)建中最佳MOI值及篩選抗生素濃度

金小花，秦高

(1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)系化學(xué)與生物技術(shù)教研室，蘇州 215008；2.上海諾百生物科技有限公司，上海 200233)

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慢病毒介導(dǎo)SiRNA沉默SGMS2基因的單克隆細(xì)胞系構(gòu)建中最佳MOI值及篩選抗生素濃度

金小花1Δ，秦高2

(1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)系化學(xué)與生物技術(shù)教研室，蘇州 215008；2.上海諾百生物科技有限公司，上海 200233)

目的 探究慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默SGMS2基因的單克隆細(xì)胞系構(gòu)建中最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)及BSD基因篩選抗生素(blasticidin)濃度。方法 熒光標(biāo)記小鼠SGMS2干擾陰性對照慢病毒并按照MOI值0、10、30、60、120(TU number/cell)分別侵染INS-1空白細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后使用熒光顯微鏡拍照并計(jì)算細(xì)胞的熒光比率(%)及死亡率(%)，以確定最佳MOI值。小鼠胰島素瘤INS-1空白細(xì)胞中加入0、1、2、3 μg/mL blasticidin，第7天時采用MTT法檢測細(xì)胞的死亡率，以確定細(xì)胞抗生素敏感濃度。使用SGMS2干擾陰性對照慢病毒及SGMS2干擾慢病毒(病毒滴度：1×108TU/mL)按照最佳MOI值侵染細(xì)胞，并用blasticidin敏感濃度進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選，獲得混合系細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞的熒光率達(dá)90%時，進(jìn)行單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建。結(jié)果 最佳MOI值為60，此時細(xì)胞的熒光率達(dá)100%，但細(xì)胞的死亡率<0.5%，細(xì)胞保持原有的形態(tài)。當(dāng)blasticidin敏感濃度為2 μg/mL，此時空白細(xì)胞失去原有的貼壁性，全部死亡。INS-1-SEMS2細(xì)胞第2次檢測的Ct值28.21大于第1次檢測的Ct值27.58，且siRNA的干擾效率為77.78%，siRNA成功表達(dá)，混合穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功。成功構(gòu)建小鼠胰島素瘤INS-1-SEMS2單克隆細(xì)胞系。結(jié)論 慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默基因SGMS2的單克隆細(xì)胞系構(gòu)建成功。

小鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞；感染復(fù)數(shù)；BSD基因篩選抗生素；細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株

在動物細(xì)胞學(xué)和分子學(xué)試驗(yàn)中，將外源目的基因通過病毒介質(zhì)轉(zhuǎn)入動物細(xì)胞中，是一個非常重要的試驗(yàn)步驟[1]。慢病毒直接包裝成為假病毒顆粒，對分裂和非分裂細(xì)胞均有感染作用，適合RNA研究和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞)[2]。將目的基因構(gòu)建到慢病毒載體中，通過慢病毒侵染細(xì)胞，將目的基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中并表達(dá)基因產(chǎn)物。本試驗(yàn)通過測定小鼠胰島素瘤INS-1空白細(xì)胞的最佳MOI值和抗生素敏感濃度，使用針對基因SGMS2的siRNA慢病毒載體侵染細(xì)胞，進(jìn)行構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，可在較短的時間內(nèi)獲得單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及病毒：小鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞(上海諾百生物科技有限公司)；SGMS2干擾陰性對照慢病毒及SGMS2干擾慢病毒(病毒滴度：1×108TU/mL)(上海諾百生物科技有限公司)。

1.1.2 試劑與儀器：RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、碘化丙錠(PI)試劑(Sigma)；0.05%胰酶(Gibco)；PBS(Beyotime)；BSD基因篩選抗生素(blasticidin)(10 mg/mL，InvivoGen)；DMSO(Beyotime)；polybrene試劑。CO2培養(yǎng)箱(MCO-175型,SANYO)；熒光顯微鏡(IX83,OLYMPUS)；生物安全柜(BCG401,BAKER)；QPCR儀(Mx3000P，Stratagene)。

1.2 方法 將小鼠胰島素瘤INS-1凍存細(xì)胞取出放入水浴鍋中復(fù)蘇，后放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞數(shù)達(dá)到80%后，進(jìn)行細(xì)胞鋪板。

1.2.1 病毒侵染小鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)值測定：病毒侵染細(xì)胞會對細(xì)胞膜造成一定損傷，MOI值(MOI值=病毒的用量/細(xì)胞的數(shù)量)過高使細(xì)胞膜的損傷超出細(xì)胞的自我修復(fù)功能，細(xì)胞的死亡率增大、形態(tài)發(fā)生改變[3]。在最佳MOI值，細(xì)胞有較高的熒光比率且病毒侵染對細(xì)胞的生長及形態(tài)影響較小，死亡率較低。設(shè)置MOI值梯度：0、10、30、60、120(TU number/cell)，將小鼠胰島素瘤INS-1空白細(xì)胞鋪板于96孔板中，鋪板細(xì)胞數(shù)為1.5×104個/孔[4]，鋪板第2天使用碘化丙錠(PI)熒光標(biāo)記小鼠SGMS2干擾陰性對照慢病毒并按照上述各MOI值分別侵染INS-1空白細(xì)胞，使用polybrene試劑作為病毒助染劑[5-6]，侵染后4 h換成新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后使用熒光顯微鏡對設(shè)定MOI值分別拍照，每個MOI值拍3張分別為：熒光、熒光和白光疊加、白光。當(dāng)細(xì)胞的熒光比率(%)(鏡下熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))在100%且細(xì)胞的死亡率(%)(死亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))小于2%，此時MOI值為細(xì)胞的最佳MOI值。每個MOI值設(shè)6個復(fù)孔。

1.2.2 小鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞對BSD基因篩選抗生素(blasticidin)的敏感性測試：由于病毒侵染細(xì)胞后，SGMS2目的基因?qū)爰?xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物。在構(gòu)建表達(dá)載體時，添加一段BSD基因(抗生素blasticidin的抗性基因)。當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入一定濃度blasticidin時，由于空白細(xì)胞中不含抗性基因片段，因此會被殺死[7-8]。但當(dāng)blasticidin濃度過高時，會造成陽性細(xì)胞表達(dá)下降，因此測定抗生素對空白細(xì)胞的最適作用濃度。

采用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，鋪板細(xì)胞數(shù)為5×104個/孔，總體積為500 μL。向小鼠胰島素瘤INS-1空白細(xì)胞中加入不同濃度blasticidin，使終濃度為0、1、2、3 μg/mL，每隔2 d觀察1次并換液，在第7天時觀察細(xì)胞的死亡率,使用熒光顯微鏡對每個blasticidin濃度各拍1張白光照片。死亡率達(dá)99%的BSD抗生素濃度為空白細(xì)胞的最佳敏感濃度。每個梯度設(shè)6個復(fù)孔。

1.2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建：將INS-1空白細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用SGMS2干擾陰性對照慢病毒及SGMS2干擾慢病毒(病毒滴度：1×108TU/mL)按照上述實(shí)驗(yàn)中確定的最佳MOI值侵染細(xì)胞，侵染48 h后將細(xì)胞消化傳至培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，加入確定的最佳blasticidin濃度進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選2～3周(此后一直使用抗性培養(yǎng)基篩選)，細(xì)胞株中陽性細(xì)胞的比率逐漸增加，獲得混合系細(xì)胞。取培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行QPCR檢測驗(yàn)證，要求第2次QPCR結(jié)果與第1次結(jié)果之差小于2個Ct，則視為穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功。INS-1空白細(xì)胞侵染后的細(xì)胞為INS-1-NC。

1.2.4 單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建：穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建成功后，當(dāng)細(xì)胞的熒光率達(dá)90%時，可進(jìn)行單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建[9]。將細(xì)胞消化、離心、重懸后，使用血球計(jì)數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，鏡下在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)為1個。接種24 h后，使用熒光顯微鏡鏡檢細(xì)胞，挑選出陽性細(xì)胞克隆的孔標(biāo)記，繼續(xù)培養(yǎng)至70%后[10]，消化后傳至3 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，5%CO2培養(yǎng)箱擴(kuò)大培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞的最佳MOI值測定 隨著MOI值的增加，干擾陰性對照慢病毒侵染INS-1空白細(xì)胞的熒光率越高，同時細(xì)胞經(jīng)慢病毒侵染后的死亡率也會逐漸升高。MOI=60時細(xì)胞侵染后，此時細(xì)胞的熒光率達(dá)100%，但細(xì)胞的死亡率<0.5%，細(xì)胞保持原有的形態(tài)，無其他異常情況。當(dāng)MOI=120時，細(xì)胞的熒光率達(dá)100%，細(xì)胞死亡率大于3%，細(xì)胞生長狀態(tài)變差，逐漸變圓，失去原有的形態(tài)，由此可判斷INS-1細(xì)胞的最佳MOI為60。見圖1、表1。

圖1 不同MOI值下小鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞熒光率與死亡率的鏡檢結(jié)果(×200)Fig.1 Fluorescence and apoptosis of mice pancreatic insulinomas INS-1 cells at different MOI by microscopic examination(×200)

檢測指標(biāo)MOI值(TUnumber/cell)0(空白細(xì)胞)103060120熒光率(%)087921001000909510010008693100100091911001000859510010008592100100細(xì)胞死亡率(%)0000.530000.433.40000.453.50000.423.20000.473.00000.463.8

2.2 小鼠胰島素瘤INS-1空白細(xì)胞對BSD抗生素的敏感性 當(dāng)blasticidin濃度為0 μg/mL時，空白細(xì)胞密度為95%左右；當(dāng)blasticidin濃度為1 μg/mL時，大于85%出現(xiàn)細(xì)胞生長狀態(tài)變差，細(xì)胞的形態(tài)變圓，明顯抑制了細(xì)胞的增殖，明顯小于blasticidin濃度為1 μg/mL時的細(xì)胞密度；當(dāng)blasticidin濃度為2 μg/mL時，空白細(xì)胞形態(tài)已全部變成圓形，細(xì)胞失去原有的貼壁性，細(xì)胞已全部死亡。因此可以得出：INS-1空白細(xì)胞對BSD抗生素的敏感濃度為2 μg/mL。見圖2、表2。

圖2 小鼠胰島素瘤INS-1空白細(xì)胞對不同濃度blasticidin的敏感性鏡檢結(jié)果(×200)Fig.2 Blasticidin sensitivity of mice pancreatic insulinomas INS-1 cells at different concentrations by microscopic examination(×200)

檢測指標(biāo)BSD抗生素濃度(μg/mL)0123細(xì)胞生長密度(%)955000964800935200954500924600945000

2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建結(jié)果 INS-1-SEMS2細(xì)胞第2次檢測的Ct值28.21大于第1次檢測的Ct值27.58，且siRNA的干擾效率為77.78%，siRNA成功地在細(xì)胞中表達(dá)，混合穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功。見表3。

表3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系QPCR檢測Tab.3 Construction of stable cell line detected by ±s)

2.4 單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建 最終成功構(gòu)建小鼠胰島素瘤INS-1-SEMS2及INS-1-NC單克隆細(xì)胞系。見圖3。

圖3 小鼠胰島素瘤INS-1-SEMS2及INS-1-NC單克隆細(xì)胞系(×200)Fig.3 Monoclonal cell line of mice pancreatic insulinomas INS-1-SEMS2 and INS-1-NC cells(×200)

3 討論

3.1 單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建 當(dāng)慢病毒侵染細(xì)胞將目的基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，目的基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)出目的產(chǎn)物后，細(xì)胞克隆成功[11]。導(dǎo)入細(xì)胞的目的基因中載有特殊的抗性基因，產(chǎn)生的基因表達(dá)產(chǎn)物，使細(xì)胞具有對特定抗生素有抗性，而空白細(xì)胞中不含有抗性基因。因此，再加入抗生素后，空白細(xì)胞缺少抗性產(chǎn)物而被殺死。設(shè)定抗生素的加藥濃度梯度，可測得空白細(xì)胞對抗生素的敏感濃度。

3.2 INS-1細(xì)胞的最佳MOI值測定 INS-1細(xì)胞的最佳MOI值測定時，可增設(shè)MOI值的梯度，使MOI值更加精確。在測定細(xì)胞最佳MOI值時，可增加一個對照組，完全培養(yǎng)基中添加polybrene和不添加polybrene作對照[12]。在侵染4 h后，換成完全培養(yǎng)基即可，在以后培養(yǎng)過程中不需要再換液。若期間換液，可能導(dǎo)致細(xì)胞生長過多，細(xì)胞之間的間距變小，細(xì)胞的形態(tài)不明顯，影響細(xì)胞MOI值的判斷。

通過試驗(yàn)可知當(dāng)MOI值為60時，細(xì)胞的熒光率在100%，細(xì)胞的死亡率最低，病毒的侵染效果最佳；抗生素的濃度為2 μg/mL時，在7～8 d時，細(xì)胞死亡率達(dá)99%以上，殺滅空白細(xì)胞的效果最佳。經(jīng)慢病毒侵染后的混合細(xì)胞株加入BSD抗生素，成功篩選出目的基因陽性表達(dá)的細(xì)胞，并建立穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株。

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(編校：王儼儼)

Optimize multiplicity of infection and selected concentration of antibiotics in construction of monoclonal stable cell line by lentivirus vector-mediated RNA interence silenced gene SGMS2

JIN Xiao-hua1Δ，QIN Gao2

(1.Teaching and Research Apartment of Chemistry and Biotechnology in Department of Food Science, Suzhou Polytechnic institute of Agriculture, Suzhou 215008, China；2.Shanghai Nuo Bai Biotechnology Limited Company，Shanghai 200233, China)

ObjectiveTo optimize multiplicity of infection (MOI) and antibiotics (blasticidin) concentration selecting BSD gene in construction of monoclonal stable cell line by lentivirus vector-mediated RNA interence silenced gene SGMS2. MethodsThe INS-1 cells were transfected by fluorescence labeled negative control SGMS2-siRNA lentivirus at MOI of 0, 10, 30, 60 and 120 TU number/cell. The cells were photographed under fluorescent microscopy after 72 h cultivation, then fluorescence ratio and apoptosis rate were calculated to determine optimal MOI. The INS-1 cells were treated by blasticidin with different concentrations of 0, 1, 2, and 3 μg/mL, and the apoptosis rate was observed to acquire optimal concentration of antibiotics. The INS-1 cells were transfected by negative control SGMS2-siRNA lentivirus and SGMS2-siRNA lentivirus (virus titer: 1×108TU/mL) at optimal MOI and positive-transfected cells were selected by blasticidin at optimal concentration, then mixed cell lines were acquired. The monoclonal cell line was constructed at fluorescence ratio of 90%. ResultsThe optimal MOI was 60 with 100% fluorescence ratio, less than 0.5% apoptosis rate and keep original cellular morphology. The optimal concentration of blasticidin was 2 μg/mL with cell adherence disappear and all cells apoptosis. The Ct value of INS-1-SEMS2 cells detected at the second time was 28.21, which was greater than 27.58 at the first time. The interfering efficiency of siRNA was 77.78% which indicated a successful expression of siRNA and construction of monoclonal stable cell line (INS-1-SEMS2). ConclusionThe monoclonal stable cell line was successfully constructed by lentivirus vector-mediated RNA interence silenced gene SGMS2.

mice pancreatic insulinomas INS-1 cells;multiplicity of infection;selecting antibiotic BSD gene;stable cell line

金小花，通訊作者，女，碩士，講師，研究方向：生物制藥，E-mail：junxiaohuadoc@163.com。

Q78

A

1005-1678(2015)09-0051-04