程序性死亡-1對骨肉瘤細胞MG-63的影響研究

錢茜，包德明，岳宗進

(1.河南中醫學院第一附屬醫院 藥學部，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學第一附屬醫院 骨科，河南 鄭州 450052；3.河南省中醫院 脊柱研究所，河南 鄭州 450002)

?

程序性死亡-1對骨肉瘤細胞MG-63的影響研究

錢茜1，包德明2，岳宗進3

(1.河南中醫學院第一附屬醫院 藥學部，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學第一附屬醫院 骨科，河南 鄭州 450052；3.河南省中醫院 脊柱研究所，河南 鄭州 450002)

目的 探討程序性死亡-1(programmed death-1，PD-1)對骨肉瘤細胞MG-63的影響。方法 從人骨肉瘤細胞株 MG-63 細胞中分選及鑒定骨肉瘤類腫瘤干細胞，MTT法檢測PD-1信號對T細胞增殖的影響；RT-PCR檢測 PD-1 mRNA表達。結果 1周內癌細胞明顯增殖，顯示出較強的增殖能力及侵襲性；腫瘤細胞球的形成依賴于血清營養的支持；血清培養基中的MG-63癌細胞增殖數量較無血清懸浮培養的骨肉瘤細胞球細胞明顯增高(P< 0.05)；RT-PCR的結果顯示多能干細胞標記CD133在癌細胞球中的表達顯著高于MG-63， 癌細胞球及MG-63的PD-1表達均明顯增加(P<0.05)。結論 MG-63細胞系具有骨肉瘤干細胞特性，能夠表達相應的細胞標記，PD-1的表達亦顯著增加，其使患者的免疫功能下調，與腫瘤的發生及進展密切相關。

PD-1；MG-63；骨肉瘤；干細胞

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是兒科最常見的骨科惡性腫瘤，最新研究顯示免疫系統的失調節可能是其中最關鍵的環節之一[1]。程序性死亡-1(programmed death-1，PD-1)亦稱為編程性細胞死亡，是CD28家族中一員，表達于激活的T細胞、B細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞[2-3]。研究證明抗PD-1抗體在癌癥治療及免疫刺激中具有重要作用，其對免疫細胞的抑制作用主要是抑制T細胞對感染的炎癥反應過程及自主免疫，當T細胞表面的PD-1受體與其靶蛋白鏈程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)及PD-L2程序性死亡配體2(programmed death-ligand 2，PD-L2)相結合后，細胞內的PD-1磷酸化使蛋白磷酸激酶聚集，如含有Src同源結構域2的蛋白酪氨酸磷酸酶(Src-homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase，SHP-2)抑制T細胞受體信號通路，阻斷PD-1通路能夠通過加強抗腫瘤免疫反應，減少抑制性T細胞數量，增強組織內T細胞活性因子活性及抗腫瘤微環境[4-6]。通過抑制PD-1通路同樣可增強自然殺傷細胞的活性，促使PD-1陽性B細胞抗體產生，PD-1及其協同抑制因子如細胞毒T細胞抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)、T細胞免疫球蛋白、黏蛋白區域3(T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3)等最常見的檢查點分子(cell surface signaling molecules，CSSMs)，扮演“收費站”的角色，判斷細胞外信號信息，決策細胞循環及是否進行其他細胞內活動，與腫瘤的進展密切相關[7-8]。MG-63為骨肉瘤細胞株，具有誘導后可顯著表達干擾素等特點，是研究骨肉瘤進展分子機制最常用的細胞系，本研究旨在探究PD-1表達對骨肉瘤細胞的影響，以期對骨肉瘤的靶向治療提供指導意義。

1 材料與方法

1.1 細胞 MG-63細胞系(購自ATCC)。

1.2 藥品與試劑 MTT粉劑(Gibco，美國)；DMEM/F12培養基(Hycfone，德國)；胰蛋白酶(Invitrogen公司)；10%胎牛血清(四季青生物工程材料有限公司)；二甲基亞砜DMSO(Amresco公司)；Trizol及RT-PCR試劑盒(Invtrogen公司)。

1.3 主要實驗儀器 自動酶標儀(Beckman公司，美國)；RT-PCR儀(CFX384 TOUCH，美國伯樂)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；CO2細胞培養箱(Heraeus BB16UV，德國)。

1.4 骨肉瘤類腫瘤干細胞的分選及鑒定 MG-63細胞系使用含 10%胎牛血清的 DMEM/F12 培養基培養，鋪滿細胞培養瓶底后傳代； 用含表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)10 ng/mL、基本成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)10 ng/mL及 N2 添加物的改良Eagle培養基/營養混合物F12(Dulbecco’s modified eagle medium: nutrient mixture F-12，DMEM/F12)無血清培養基及超低粘附細胞培養板懸浮培養 MG-63 細胞，培養 7～12 d后可形成 50 個以上細胞組成的骨肉瘤細胞球，將骨肉瘤細胞球吹散，重新加入到無血清懸浮培養基中，觀察是否再次成球；將骨肉瘤細胞球重新接種到含血清培養基中，觀察其生長情況。

1.5 骨肉瘤MG-63與腫瘤細胞球增殖比較 收集人骨肉瘤 MG-63 細胞及無血清懸浮培養 7～10 d的骨肉瘤細胞球行四唑鹽比色(MTT)實驗。取MTT溶于10 mL 0.1M PBS中配成5 mg/mL MTT溶液。全自動酶標儀檢測細胞在590 nm吸光度A值，減去空白對照組(無細胞，僅MTT 200 μL，二甲基亞砜DMSO 150 μL)數值，實驗重復3次，比較 MG-63 細胞及骨肉瘤細胞球在含 EGF(10 ng/mL)、b-FGF(10 ng/mL)及N2 添加物的 DMEM/F12 無血清培養基中1～7 d的生長情況，以培養時間為橫軸，吸光度A值為縱軸繪制生長曲線。

1.6 RT-PCR檢測mRNA表達 收集骨肉瘤細胞球，用Trizol抽提總mRNA，按TaKaRa逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA，取1 μL逆轉錄反應產物于20 μL(10 pmol引物)反應體系中擴增cDNA，35個循環，每個循環中94°C 30s變性，30 s 退火，60 s 72 ℃條件下延伸。PCR產物經1%瓊脂凝膠電泳，通過溴乙非啶染色，β-actin作為分子量參考，獲得條帶使用Image J軟件量化灰度值。相關基因序列查自Gene Bank，應用專業引物設計軟件Primer 5.0設計，由上海生物工程技術公司合成，具體序列如下：β-actin：上游 5’ GTCCACCGCAAATGCTTCTA3’, 下游5’TGCTGTCACCTTCACCGTTC3’, 190 bp; CD133: 上游 5’GTTCTTAGGACAGATTTGGATGG3’, 下游5’CCTTTTGATA-CCTGCTACGACA3’, 111 bp; MDRI: 上游 5’AGAAGATTGTC-CCCAAGAAGA3’, 下游5’GGAAGTGGTGGCTGAGGTT3’, 138 bp; OCT3/4: 上游 5’AGCCACCACTCACCCTACTGC3’, 下游5’CTGGAGCCCATTGTCCGTTAC3’, 154 bp; PD-1: 上游 5’GCTGATGGCAACTTCAACTG3’, 下游5’GATCAGCTCGGGCA-CTTTAG3’, 105 bp; nestin: 上游 5’AGCGTCAACAGGGAGA-TGTC3’, 下游5’TTCCACAAAGGCATCCCAGC3’, 120 bp; nanog: 上游 5’ATGGCACCGTCAAGGCTGAG3’, 下游5’GCAGTGATGGCATGGACTGT3’, 179 bp。

2 結果

2.1 骨肉瘤細胞增殖 絕大多數細胞成梭形或多邊形，無接觸性抑制，見圖1。圖1-A、1-B顯示為1周內癌細胞明顯增殖，表現出較強的增殖能力及侵襲性；圖1-C、1-D分別為MG-63于含 10%胎牛血清或不含血清培養基上培養10d所形成腫瘤細胞球，前者癌細胞的數量和所形成的腫瘤體積顯著增加，若將骨肉瘤細胞球吹散，重新加入無血清懸浮培養基中，則12d時未發現明顯腫瘤細胞球形成；圖1-E，1-F顯示：將骨肉瘤細胞球重新接種到含血清培養環境中后癌細胞明顯增殖，形成腫瘤細胞球，同時12d左右可見癌細胞向周邊侵襲擴散，表明MG-63細胞株中存在干細胞特征細胞，具有較強的增殖能力及侵襲性，與其他惡性腫瘤特征基本一致，其對營養物質的需求性較強。

圖1 骨肉瘤細胞增殖圖(×40)A：含血清培養基上1 d癌細胞生長鏡檢圖片；B：含血清培養基上7 d癌細胞生長鏡檢圖片；C：10%胎牛血清中癌細胞生長10 d所形成的細胞球；D：不含血清時10 d所形成的癌細胞球；E：將骨肉瘤細胞球重新接種到含血清培養環境中后癌細胞增殖，7 d形成腫瘤細胞球；F：將骨肉瘤細胞球重新接種到含血清培養環境中后12 d左右可見癌細胞向周邊侵襲擴散Fig.1 Osteosarcoma cells proliferation(×40)A: Microscopic examination of cancer cell growth at 1d on the medium containing serum;B: Microscopic examination of cancer cell growth at 7d on the medium containing serum;C: Cells sphere of cancer cells growth 10d in 10% fetal bovine serum;D: Formed cancer sphere at 10 d when the serum free of serum;E: The tumor cells were re- seeded in the serum of the tumor cells, and the tumor cells were formed by 7 d;F: The tumor cells were re-inoculated into the serum containing culture environment and the invasion and diffusion of the tumor cells to the surrounding cells were observed after 12 d.

2.2 骨肉瘤MG-63與腫瘤細胞球增殖比較 MTT法檢測MG-63 細胞及無血清懸浮培養的骨肉瘤細胞球細胞在1～7d的增殖情況，與顯微鏡下觀察結果基本一致，血清培養基中的MG-63癌細胞增殖數量明顯增高，7 d后2種細胞增殖均進入平臺期。見圖2。

圖2 MG-63 細胞及無血清懸浮培養的骨肉瘤細胞球細胞1～7 d細胞吸光度A值變化Fig.2 Absorbance value changes of MG-63 and osteosarcoma cells spheres cultured in serum-free medium in 1～7 days

2.3 RT-PCR檢測癌細胞mRNA表達 RT-PCR顯示特異性多能干細胞標志(CD133)及胚胎干細胞標志(OCT3/4，nestin及Nanog)癌細胞球中表達明顯增強；PD-1 mRNA在癌細胞球中表達亦明顯增強且細胞球的分子標記表達均顯著增加，見圖3。

圖3 骨肉瘤細胞RT-PCR檢測(A)及條帶灰度值(B)Fig.3 RT-PCR test(A) and the grey bar value(B) of osteosarcoma cells

3 討論

MG-63細胞非單克隆，具有異生性，很多研究者認為從細胞系純化單克隆細胞對細胞學的研究十分重要[9-10]。為從MG-63細胞中獲得單克隆干細胞樣細胞，本研究首先確認了相關的亞群，其主要是圓形或橢圓形的密集分布的克隆細胞，具有腫瘤形成活性，但培養的單克隆細胞并不能持續保持特異的形態及特征，而是發生再分化或自我克隆進行傳代，因此本研究中每項實驗所使用的細胞均來源于同系。

癌細胞的遷移、入侵、粘附及生長分析是最常用的判斷細胞活性的方法，其反映出腫瘤離開原發病灶細胞外基質，體內進行分散并克隆增殖[11-15]。本研究發現早期傳代中腫瘤細胞的增殖率相對較低，但隨著傳代的增加，增值率有所升高，細胞間的入侵及轉移能力無明顯差異，克隆能力較強。

腫瘤干細胞主要表達間充質干細胞的標記物(CD29，CD44，CD45及CD105)，并且表達了很多來源于中胚層、內外胚層的基因[16-17]。腫瘤球高表達胚胎干細胞標記：Oct3/4，nestin及Nanog。相反地MG-63細胞內此類基因的表達相對較低。90%以上的癌細胞球細胞表達多能干細胞標記CD133，而MG-63細胞表達較低。進一步的研究顯示干細胞類的標記物常見于腫瘤球形成的早期階段，隨著球體積的增加及細胞數目的增加，表達水平隨之下降，提示腫瘤細胞逐漸獲得異質性。因此結果提示原始腫瘤干細胞進行了非均性分裂至均性分裂的轉變，隨之產生大量異質性前體細胞。Oct-3/4是POU家族中的轉錄因子，胚胎早期階段主要表達于內胚層，與保持胚胎干細胞的多能性相關，隨著胚胎的生長其表達逐漸下調[18-20]。Nanog基因的表達不常見于體細胞，此基因的激活對自我更新的控制及保持胚胎干細胞的多能性至關重要[21]。本研究中Nanog基因在癌細胞球細胞中的表達明顯增高，提示癌細胞球細胞如胚胎干細胞一樣具有多向分化潛能。Oct3/4、Nanog、nestin與細胞的分化及自我更新相關，如果此類蛋白在腫瘤樣干細胞內起到相同的作用，則其將成為骨肉瘤的較為理想的靶向治療。

PD-1作為協同抑制受體負性調節T細胞功能，經抗原激活的CD8+T細胞表面PD-1的高水平表達與T細胞耗竭相關，使CD8+T細胞的增殖能力、產生白介素2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(INF-γ)等細胞因子的能力逐漸喪失。表達PD-1的CD8+T細胞已被發現于腫瘤入侵的淋巴細胞內，且在慢性病毒性感染時[22]。CD4+T細胞上的PD-1功能目前尚不明確，研究顯示PD-1能夠顯著限制免疫刺激后CD4+T細胞的聚集， 不同程度的疾病中表達PD-1的CD4+T細胞調節作用不同，提示PD-1在CD4+T細胞中的表達可能與疾病的進展密切相關[23]。骨肉瘤中CD4+及CD8+T細胞的PD-1表達上調，伴有腫瘤轉移、晚期腫瘤或合并病理性骨折的患者PD-1水平更高。RT-PCR結果顯示隨著骨肉瘤細胞的增殖及侵襲性增強，PD-1的表達明顯上調，提示其與腫瘤的發生及進展有關。

綜上所述，MG-63細胞系具有骨肉瘤干細胞特性，能夠表達相應的細胞標記，PD-1的表達亦顯著增加，PD-1與腫瘤的發生及進展密切相關。

[1] Luetke A, Meyers PA, Lewis I, et al.Osteosarcoma treatment - where do we stand? A state of the art review[J].Cancer Treat Rev,2014,40(4):523-532.

[2] Fleuren ED, Versleijen-Jonkers YM, Boerman OC, et al.Targeting receptor tyrosine kinases in osteosarcoma and Ewing sarcoma: current hurdles and future perspectives[J].Biochim Biophys Acta,2014,1845(2):266-276.

[3] Botter SM, Neri D, Fuchs B.Recent advances in osteosarcoma[J].Curr Opin Pharmacol,2014,16:15-23.

[4] Akiyama T, Dass CR, Choong PF.Novel therapeutic strategy for osteosarcoma targeting osteoclast differentiation, bone-resorbing activity, and apoptosis pathway[J].Mol Cancer Ther，2008，7(11):3461-3469.

[5] Pedoeem A, Azoulay-Alfaguter I, Strazza M, et al.Programmed death-1 pathway in cancer and autoimmunity[J].Clin Immunol,2014,153(1):145-152.

[6] Notaro A, Sabella S, Pellerito O, et al.Involvement of PAR-4 in cannabinoid-dependent sensitization of osteosarcoma cells to TRAIL-induced apoptosis[J].Int J Biol Sci,2014,10(5):466-478.

[7] Wang Y, Wei Y, Zhang H, et al.Arsenic trioxide induces apoptosis of p53 null osteosarcoma MG-63 cells through the inhibition of catalase[J].Med Oncol,2012,29(2):1328-1334.

[8] Zhu Y, Ma N, Li HX, et al.Berberine induces apoptosis and DNA damage in MG-63 human osteosarcoma cells[J].Mol Med Rep,2014,10(4):1734-1738.

[9] Lu T, Huang CC, Lu YC, et al.Desipramine-induced Ca-independent apoptosis in MG-63 human osteosarcoma cells: dependence on P38 mitogen-activated protein kinase-regulated activation of caspase 3[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2009,36(3):297-303.

[10] Zhang J, Zuo J, Lei M, et al.Ezrin promotes invasion and migration of the MG-63 osteosarcoma cell[J].Chin Med J (Engl),2014,127(10):1954-1959.

[11] Gadhavi A, Wilson M, Tabona P, et al.Inhibition of mitosis and induction of apoptosis in MG-63 human osteosarcoma-derived cells in vitro by surface proteins from Actinobacillus actinomycetemcomintans[J].Arch Oral Biol,2000,45(8):707-711.

[12] Raile K, Hille R, Laue S, et al.Insulin-like growth factor I (IGF-I) stimulates proliferation but also increases caspase-3 activity, Annexin-V binding, and DNA-fragmentation in human MG-63 osteosarcoma cells: co-activation of pro- and anti-apoptotic pathways by IGF-I[J].Horm Metab Res,2003,35(11-12):786-793.

[13] Adah A, Benghuzzi H, Tucci M, et al.Metabolic effects of fructose 1,6-bisphosphate in normoxic and hypoxic states of MG-63 osteosarcoma cells[J].Biomed Sci Instrum,2006,42:120-125.

[14] Costa-Rodrigues J, Teixeira CA, Fernandes MH.Paracrine-mediated osteoclastogenesis by the osteosarcoma MG-63 cell line: is RANKL/RANK signalling really important?[J].Clin Exp Metastasis,2011,28(6):505-514.

[15] Dean DD, Schwartz Z, Liu Y, et al.The effect of ultra-high molecular weight polyethylene wear debris on MG-63 osteosarcoma cells in vitro[J].J Bone Joint Surg Am,1999,81(4):452-461.

[16] Hu Y, Xu S, Jin W, et al.Effect of the PTEN gene on adhesion, invasion and metastasis of osteosarcoma cells[J].Oncol Rep,2014,32(4):1741-1747.

[17] Correia I, Arantes-Rodrigues R, Pinto-Leite R, et al.Effects of naproxen on cell proliferation and genotoxicity in MG-63 osteosarcoma cell line[J].J Toxicol Environ Health A,2014,77(14-16):916-923.

[18] 何小進，曾德華，張雄.姜黃素對人骨肉瘤MG-63細胞增殖及Wnt/β-catenin信號通路相關基因表達的影響[J].中國生物制品學雜志,2012,25(1):78-81, 90.

[19] 游浩，張覓，劉洋，等.阻斷Notch信號通路抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖的實驗研究[J].華中科技大學學報(醫學版),2014,43(5):541-545.

[20] He Y,Liang X, Meng C, et al.Genetic polymorphisms of interleukin-1 beta and osteosarcoma risk[J].Int Orthop,2014,38(8):1671-1676.

[21] Chong Y, Zhang J, Guo X, et al.MicroRNA-503 acts as a tumor suppressor in osteosarcoma by targeting L1CAM[J].PLoS One,2014,9(12):e114585.

[22] Brown LC, Lester RA, Grams MP, et al.Stereotactic body radiotherapy for metastatic and recurrent ewing sarcoma and osteosarcoma[J].Sarcoma,2014,2014:418270.

[23] Sotgia F,Martinez-Outschoorn UE,Lisanti MP.The reverse Warburg effect in osteosarcoma[J].Oncotarget,2014,5(18):7982-7983.

(編校：王冬梅)

Effect of programmed death-1 on human osteosarcoma cells MG-63

QIAN Qian1, BAO De-ming2, YUE Zong-jin3

(1.Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China; 2. Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China; 3.Spinal Institute, He’nan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, China)

ObjectiveTo discuss the influences of programmed death-1 (PD-1) factor on osteosarcoma cells MG-63.MethodsOsteosarcoma stem cells were sovted and identified through osteosarcoma cell strain MG-63 cells.The influence of PD-1 signal on T cells proliferation were detected by MTT.The expression of PD-1 mRNA was detected by RT-PCR.ResultsCancer cells had an obvious proliferation within one week, which showed the strong ability of proliferation and aggressivity.The formation of tumor cells spheres depended on the support of serum nutrition.The number of MG-63 cells proliferation in serum culture medium was significantly higher than the osteosarcoma cells spheres in serum-free suspension culture (P<0.05).Pluripotent stem cell marks that the expression of CD133 in cancer cell sphere was significantly higher than that of MG-63(P<0.05).RT-PCR results showed the PD-1 expression level of cancer cell sphere and MG-63 were increased significantly.ConclusionMG-63 cell line has the character istics of osteosarcoma stem cells.MG-63 cell line can express the corresponding cell markers.The expression of PD-1 also increase significantly which can reduce immune function of patients and is closely related with the occurrence and development of tumors.

PD-1; MG-63; osteosarcoma; stem cells

河南省科技攻關計劃(122102310186)

錢茜，女，碩士，主任藥師，研究方向：藥學，E-mail:qianxi1966@163.com。

R738.7

A

1005-1678(2015)05-0040-04