腈水合酶交聯酶聚集體在生成煙酰胺體系中的應用

姜艷軍，牟海霞，周麗亞，高靜

（河北工業大學化工學院，天津 300130）

腈水合酶交聯酶聚集體在生成煙酰胺體系中的應用

姜艷軍，牟海霞，周麗亞，高靜

（河北工業大學化工學院，天津 300130）

采用交聯酶聚集體（CLEAs）技術和球化酶技術對來自大腸桿菌的ES-NHT-118腈水合酶進行固定化．利用大分子葡聚糖醛作為交聯劑交聯腈水合酶，在優化了溫度、pH、交聯劑用量及交聯時間后，腈水合酶CLEAs和球化酶的酶活回收率分別達到49.63%及52.88%．利用掃描電子顯微鏡對2種固定化酶進行了表征，將固定化酶用于催化3-腈基吡啶轉化生成煙酰胺．同游離酶相比，腈水合酶CLEAs和球化酶顯示了良好的pH穩定性和熱穩定性，對高濃度底物的耐受性也有提升．酶活為4 U/m L，底物終濃度為50 mmol/L時，2種固定化酶在重復使用10次后分別保留了73.45%及61.26%的催化產率．

腈水合酶；固定化酶；交聯酶聚集體；葡聚糖醛；球化酶

腈水合酶（EC 4.2.1.84）是一種可以將腈類物質轉化為酰胺類物質的酶，例如：在全細胞或者游離的腈水合酶的催化作用下，丙烯腈可以轉化為丙烯酰胺，3-腈基吡啶可以轉化為煙酰胺．酰胺類物質在有機合成、醫藥、農藥等方面有著十分重要的應用[1-4]．同全細胞相比，游離的腈水合酶更受青睞，因為它具有嚴格的化學、區域和對映選擇性及底物專一性[5-6]．但是，游離酶的使用通常會因為價格昂貴，溫度、pH和操作穩定性低，難以回收利用等因素受到限制．

將酶進行固定化可以在一定程度上提高酶的耐受性，并且能夠循環使用，方便下游過程的操作．目前報道的腈水合酶固定化技術主要包括交聯酶聚集體（CLEAs）技術、溶膠-凝膠包埋技術等[7-9]．交聯酶聚集體技術是一種無載體固定化技術，通過酶分子的氨基和交聯劑的醛基形成席夫堿使酶分子連接，這種方法幾乎可以適用于任何種類的酶，如青霉素酰化酶，甲醇脫氫酶，脂肪酶，漆酶，腈水解酶[10-13]等．通過交聯酶聚集體技術制備的固定化酶具有穩定性較高、容易回收及可重復使用的特點，同時擁有高酶活回收率[14-17]．由于戊二醛價格低廉且容易獲取，是CLEAs形成過程中最常用的交聯劑．其缺點是，一些酶經過戊二醛交聯后只有少量酶活性保留甚至完全失去活性[18-19]．為了解決這個問題，有報道采用由葡聚糖氧化制得的葡聚糖醛作為交聯劑制備CLEAs[20-21]．

同戊二醛交聯相比，經過葡聚糖醛交聯的酶活明顯提高，葡聚糖醛的使用在一定程度上解決了CLEAs酶活回收率低的問題，但CLEAs形貌和大小仍是不可控的．在應用過程中經過離心或過濾分離后，CLEAs團聚比較緊密，很難再重新分散到應用體系中．Brady課題組提出了一種球化酶技術，即將含酶的親水相分散在油相中，形成油包水乳化液，再利用雙功能或者多功能交聯試劑將乳化液中的酶分子進行交聯，固定成球狀，該課題組成功將球化酶技術用于脂肪酶的固定[22]．球化酶在水油兩相中形成，可以在一定程度上影響酶的方向，有利于酶在兩相界面上定位；球化酶技術形成的是粒徑可控的球狀結構，有利于固定化酶在反應體系中的分散，且球狀結構擁有較大的比表面積更利于固定化酶與底物接觸反應．同時，球化酶的制備過程簡單，成本低廉，因此本實驗將引入球化酶技術對腈水合酶進行固定化．

本實驗采用產自大腸桿菌的ES-NHT-118腈水合酶為模型酶，以葡聚糖醛作為交聯劑，分別采用交聯酶聚集體技術和球化酶技術對腈水合酶進行固定化．考察并優化了固定化酶的制備條件，探究了pH、溫度及高濃度底物對固定化酶催化效率的影響，并對酶的重復使用性進行了考察．

1 材料及方法

1.1 實驗材料

腈水合酶ES-NHT-118，購買自浙江寶賽生物科技有限公司，菌種為重組大腸桿菌．葡聚糖、NaIO4、戊二醛、Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O、H3PO4、苯、甲苯、3-腈基吡啶這些試劑均為分析純．蛋清液取自新鮮雞蛋．

1.2 實驗儀器

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；冷凍干燥機，北京博醫康技術公司；離心機，Baida；電子天平、pH計，上海精密科學儀器有限公司；高效液相色譜，Agilent Technologies．

1.3 實驗方法

1.3.1 葡聚糖醛的制備

1.65 g的葡聚糖溶于50mL蒸餾水，向其中加入3.85g高碘酸鈉（過量），混合液在室溫下攪拌反應90m in．反應后的溶液經過透析膜透析去除殘余高碘酸鈉，冷凍干燥后備用．

1.3.2 腈水合酶CLEAs的制備

1m L腈水合酶加入0.1m L蛋清及2m L飽和硫酸銨溶液，4℃磁力攪拌30m in后加入0.1m L葡聚糖醛（30mg/m L），繼續反應2 h后離心（5000 r/m in，5m in），沉淀用0.05mol/L pH為7的磷酸緩沖液（PBS）洗滌3次即制備得到CLEAs．

1.3.3 球化腈水合酶的制備

在4℃攪拌狀態下，向含5m L苯/甲苯溶液（體積比為3∶1），及0.2 g span-20的離心管中逐滴加入1m L蛋清蛋白，攪拌乳化0.5h后向其中加入0.1m L 25%（質量分數）戊二醛，交聯0.5h后停止攪拌．4℃冰箱冷藏4 h穩定交聯，反應結束后離心，棄上清液，蛋清蛋白球用蒸餾水洗滌3次．

稱取0.1 g濕球化蛋白，定容至1m L后與0.1mL葡聚糖醛（30mg/m L）溶液反應2 h，使葡聚糖醛連接在蛋白球表面．離心棄上清液，沉淀用PBS洗滌3次以去除殘留的葡聚糖醛．向修飾后的蛋白球中加入1m L游離酶和1m L飽和硫酸銨溶液，交聯3h后離心棄上清液，沉淀用PBS洗滌3次，獲得球化腈水合酶，冷藏備用．

1.3.4 酶活定義及測定

酶活檢測：向一定量的酶中加入終濃度為50mmol/L的3-腈基吡啶，30℃反應5m in，向反應體系中加入1mLHCl(1mol/L)終止反應．過濾后，用高效液相色譜對反應液進行檢測．檢測條件為：使用4.6×100的C18柱進行分離，流動相為NaH2PO4-H3PO4緩沖液（pH=2.8）與乙腈的混合液（體積比為80∶20），在室溫下以1m L/m in的流速流動，使用DAD檢測器在235 nm條件下檢測．

1.3.5 CLEAs和球化酶的電鏡表征

將制備好的CLEAs和球化酶均勻分散于水相中，將分散有2種固定化酶的液體小心的滴加在硅片上，干燥后利用掃描電子顯微鏡（SEM ZeissDSM-950）檢測固定化酶的形貌．

1.3.6 不同濃度的酶催化50mmol/L 3-腈基吡啶的進程曲線

在30℃下，分別取5m L不同濃度的游離酶（0.4～3.2mg/m L）溶液，向其中加入5 m L終濃度為50mmo l/L的3-腈基吡啶開始反應．每隔一定時間取0.1m L反應液加入1mol/LHCl稀釋并終止反應．過濾后用液相色譜測定底物的生成量并確定產率．

1.3.7 pH對煙酰胺產率的影響

在一定量pH為4～10的游離酶、CLEAs和球化酶中分別加入終濃度為50mmol/L 3-腈基吡啶，30℃下反應1h，取0.1m L反應液加入1mol/LHCl稀釋并終止反應．過濾后用液相色譜測定底物的生成量并確定產率．1.3.8溫度對煙酰胺產率的影響

在一定量pH為7的游離酶、CLEAs和球化酶中分別加入終濃度為50 mmol/L 3-腈基吡啶，不同溫度下反應1h，取0.1m L反應液加入1mol/LHCl稀釋并終止反應．過濾后用液相色譜測定底物的生成量并確定產率．

1.3.9 CLEAs和球化腈水合酶的熱穩定性

取一定量的游離酶、CLEAs和球化酶，分別在30℃、40℃、50℃的水浴中放置1～6h，在冰水浴中快速降溫后分別加入終濃度為50mmol/L 3-腈基吡啶，在30℃下反應4 h，取0.1m L加入1mol/L HCl稀釋并終止反應．過濾后用液相色譜測定底物的生成量并確定產率．

1.3.10 游離酶、CLEAs和球化酶催化不同濃度3-腈基吡啶的進程曲線

在30℃下，分別取5m L 4U/m L的游離酶、CLEAs和球化酶加入5m L不同濃度的3-腈基吡啶（終濃度50～300mmol/L），每隔一定時間取0.1m L加入1mol/L HCl稀釋并終止反應．過濾后用液相色譜測定底物的生成量并確定產率．

1.3.11 CLEAs和球化酶的重復使用性

在30℃下，分別取10U的腈水合酶CLEAs和球化酶中加入5m L不同濃度的3-腈基吡啶（終濃度50～200mmol/L），反應4 h后離心，取0.1m L上清液加入1mol/LHCl稀釋并終止反應．過濾后用液相色譜測定底物的生成量并確定產率．再將固定化酶離心洗滌3次，去上清液，加入5 m L對應終濃度底物，繼續新一輪反應．

所有實驗數據均取3次平行實驗結果的均值．

2 結果與討論

2.1 CLEAs和球化酶的電鏡表征

利用葡聚糖醛作為交聯劑，采用了交聯酶聚集體技術和球化酶技術對腈水合酶酶進行固定化，按照1.3.5方法，利用掃描電子顯微鏡對CLEAs和球化酶的形貌進行表征，其結果如圖1所示．

由圖1a）可以看出，葡聚糖醛交聯的CLEAs呈多孔的無規則結構，多孔的存在有利于反應底物及產物的自由進出，極大程度的降低擴散限制從而提高酶活性[19]．然而，不規則的形貌使CLEAs在離心或過濾后會緊密聚集，難于分散重復使用，且這種情況會隨著離心次數的增多而加劇．

2.2 酶濃度對煙酰胺產率的影響

當底物濃度一定時，為了防止酶的浪費，按照1.3.6方法，研究了不同酶濃度催化50 mmol/L 3-腈基吡啶對煙酰胺產率的影響，并確定50mmol/L底物對應的適宜酶量和反應時間，其結果如圖2所示．

圖1 CLEAs和球化酶的掃描電鏡圖Fig.1 SEM imagesof CLEAs and Spherezymes

從圖2中可以看出，酶濃度為0.4～3.2mg/m L，催化50mmol/L3-腈基吡啶反應10h后，煙酰胺產率分別為36.82%，70.32%，98.59%，98.51%，99.64%．在酶濃度低于1.6mg/m L時，煙酰胺產率隨酶濃度的增加而增大，在1.6mg/mL時達到最大值，繼續增加酶濃度，產率沒有明顯改變．因此，選定酶濃度為1.6mg/m L用于后續實驗，此時酶活性約為4 U/m L．

2.3 pH對煙酰胺產率的影響

為了使酶在反應過程中有適宜的pH環境，按照1.3.7方法，研究了不同pH對煙酰胺產率的影響，其結果如圖3所示．

從圖3中可以看出，3種酶均在pH為7的條件下展現了最高的產率，游離酶、CLEAs和球化腈水合酶在pH為7對應的煙酰胺產率分別為54.14%、55.15%和57.75%，說明游離酶的最適pH接近7，且經過固定化后最適pH未發生改變．此外，固定化后的腈水合酶對pH的耐受性有了一定程度的提高，如在pH為4時，游離酶的煙酰胺產率為0.98%，CLEAs和球化腈水合酶的煙酰胺產率分別為26.74%和29.01%，在pH為10的環境中，游離酶的煙酰胺產率為5.42%，CLEAs和球化腈水合酶的煙酰胺產率分別為37.37%和33.27%．通過數據結果對比可得，經過固定化以后的酶在酸性和堿性環境中的耐受性都有一定程度的提高．因為固定化酶經過交聯作用，使酶的亞基更加穩定，在面對pH、溫度、高濃度底物的影響時，表現出了更好的穩定性，同游離酶相比，表現了更高的催化效率．

2.4 溫度對煙酰胺產率的影響

溫度升高有利于底物與酶分子的接觸反應，但同時過高的溫度也會使酶變性失活，因此，為確定最適宜的反應溫度，按照1.3.8方法，研究了不同溫度對煙酰胺產率的影響，其結果如圖4所示．

圖2 酶濃度對煙酰胺產率的影響Fig.2 Effectofenzyme concentration on theyield of nicotinam ide

圖3 pH對煙酰胺產率的影響Fig.3 Effectof pH on theyield ofnicotinamide

由圖4可以看出，游離酶、CLEAs和球化酶的最適溫度分別在30℃、50℃、40℃，對應的煙酰胺產率分別為54.97%、68.64%和60.37%．固定化酶同游離酶相比，在高溫條件下的催化效率更高，說明同樣條件下固定化酶由于高溫變形造成的酶活性損失更小．因為經過交聯，酶分子通過交聯劑連接，在高溫條件下酶分子受分子間作用力的影響，使自身的構象更加穩定．CLEAs的最適溫度比球化酶更高，可能是因為它在無規則連接的過程中受到更多交聯劑的連接，使得它受更過分子間作用力，從而比球化酶的構象更穩定．

2.5 CLEAs和球化酶的熱穩定性

由于酶在應用過程中會長時間處于一個溫度條件下，有必要對酶的熱穩定性進行考察．根據溫度影響的結果，選取了30℃、40℃、50℃為CLEAs和球化酶的熱穩定性的測試溫度，按照1.3.9節方法，研究CLEAs和球化酶的熱穩定性，其結果如圖5所示．

圖4 溫度對煙酰胺產率的影響Fig.4 Effectof temperatureon the yield ofnicotinam ide

圖5 CLEAs和球化腈水合酶的熱穩定性Fig.5 The thermalstabilitiesof CLEAs and spherezymes

從圖5中可以看出，隨著溫度的增加和孵化時間的延長，溫度對酶活性的影響逐漸增加．CLEAs在30℃、40℃下反應基本穩定，在6h孵化以后煙酰胺產率分別為96.24%和89.23%．球化酶在30℃條件下能比較穩定的反應，6 h孵化以后能保持99.06%的煙酰胺產率．在50℃條件下孵化6 h，2種固定化酶失去了大部分活性，煙酰胺產率分別只有8.42%和5.36%．穩定性測試的結果進一步表明CLEAs的熱穩定性略優于球化酶，但CLEAs在50℃條件下也不能長時間穩定的存活．為了使固定化酶在長時間的實驗過程中能夠更好的發揮催化作用，選取30℃為反應條件．

2.6 游離酶、CLEAs和球化酶催化不同濃度3-腈基吡啶的進程曲線

腈水合酶的底物為腈類物質，是一類有毒物質，在催化過程中底物會對酶分子產生毒害作用，高濃度底物會使酶活性降低甚至失活．按照1.3.10節方法，在酶活相同的狀態下，研究3種酶催化不同濃度的3-腈基吡啶對煙酰胺產率的影響，考察了游離酶、CLEAs及球化酶對底物3-腈基吡啶的耐受性，其結果如圖6所示．

從圖6中可以看出，在底物終濃度為50mmol/L時，反應10h后，游離酶、CLEAs及球化酶催化的煙酰胺產率分別為98.35%、97.80%和98.21%，在底物終濃度為100mmol/L時，反應10h后，游離酶、CLEAs及球化酶催化的煙酰胺產率分別為79.24%、91.29%和89.23%，在底物終濃度為200mmol/L時，反應10 h后，游離酶、CLEAs及球化酶催化的煙酰胺產率分別為31.01%、64.26%和59.23%．對比數據可以得出，隨底物濃度的增加，3種酶催化產物的產率都在逐漸降低，在經過固定化后，固定化酶對高濃度的底物耐受性較游離酶有所提高，且CLEAs略優于球化酶．

圖6 高濃度底物對煙酰胺產率的影響Fig.6 Theeffectofhigh concentrationsof substrate on theyield of nicotinamide

2.7 CLEAs和球化酶的重復使用性

經過固定化以后，能夠重復使用是固定化酶相比游離酶的一個極大的優勢，重復使用能夠降低使用成本．按照1.3.11節方法，研究了不同CLEAs和球化酶的重復使用性，其結果如圖7所示．

由圖7a）可以看出，在底物終濃度50 mmol/L的條件下，經過10次重復使用以后，CLEAs和球化酶催化的煙酰胺產率分別為73.45%，61.26%，表現出了較好的重復使用性．但是隨著底物濃度的增加，底物對酶的累積影響越來越明顯，重復使用效率會隨著底物濃度的增大明顯降低．由圖7b）可以看出，在底物終濃度100mmol/L的條件下，CLEAs和球化酶的催化產率在重復7次的時候產率分別為35.91%和27.32%，低于了初次的50%．如圖7c）所示，在底物終濃度200mmol/L的條件下，CLEAs和球化酶的催化產率在重復5次的時候產率就低于了初次的50%，對應產率分別為22.44%，14.82%．除了底物對酶的影響造成酶活損失以外，每次洗滌過程中還會對固定化酶造成一定程度的損失，操作過程中因盡量小心，減少過程中酶的損失．

圖7 CLEAs和球化酶的重復使用性Fig.7 Reusability of CLEAs and spherezymes

3 結論

為了提高酶活回收率，本文以葡聚糖醛為交聯劑，采用了交聯酶聚集體和球化酶2種方法固定化腈水合酶，對固定化酶的形貌進行了電鏡表征，并對固定化酶性能進行了研究，得到以下結論：

1）葡聚糖醛交聯的CLEAs是含有多孔的無規則結構，多孔的存在有利于反應底物及產物的自由進出，極大程度的降低擴散限制從而提高酶活性．球化腈水合酶為粒徑主要分布在8～20m的球狀結構，在應用過程中體現了比CLEAs更好的重懸性．

2）經過固定化以后，同游離酶相比，固定化酶有著更好的pH、熱穩定性，對高濃度底物的耐受性更強，在底物終濃度50 mmol/L的條件下，經過10次重復使用，CLEAs和球化酶表現了良好的重復使用性．這些性能使固定化酶在應用中更有優勢．

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[責任編輯 田豐]

Theapplication of nitrilehydratase cross-linked enzymeaggregates in thegenerated system of nicotinam ide

JIANG Yanjun，MU Haixia，ZHOU Liya，GAO Jing

(Schoolof Chemical Engineering,HebeiUniversity of Technology,Tianjin 300130,China)

Cross-linked enzymeaggregates(CLEAs)and spherezymesofnitrilehydratase(NHase)ES-NHT-118 from E.coliwere prepared.Dextran polyaldehyde,amacromolecular cross-linker,wasemployed to cross-link NHase for the first time.A fter having optim ized the tem perature,pH,concentration of the cross-linker and the cross-linking time in the process of preparation,NHase CLEAs and spherezymes have obtained 49.63%，52.88%of activity recovery,respectively.Themorphology of CLEAsand spherezymeswereanalyzed by using scanning electronm icroscopy(SEM). The immobilized enzymesw ere em p loyed to catalyze 3-cyanopyridine converted to nicotinam ide.The NHase CLEAs and spherezymes exhibited increased stability at varied pH and temperature conditions w hen compared with its free counterpart.Whenexposed tohigh concentrationsofacrylamide,immobilized enzymesalsoexhibitedeffectivecatalytic activity.Whenhaving reached theeffectof50mmol/L 3-cyanopyridine,4U/m LNHase CLEAsand spherezymeskept respectively 74.37%，63.95%of theiroriginalactivity afterbeing recycled ten times.

nitrilehydratase;immobilized enzyme;cross-linked enzymeaggregates（CLEAs）;extran polyaldehyde; spherezymes

Q814.2

A

1007-2373(2015)02-0068-07

10.14081/j.cnki.hgdxb.2015.02.015

2015-01-23

國家自然科學基金（21276062）；河北省高等學校科學技術研究重點項目（YQ2013025）；天津市自然科學基金（13JCYBJC18500）；天津市高等學校科技發展基金計劃項目（20140513）

姜艷軍（1980-），男（漢族），副教授，博士，yanjunjiang@hebut.edu.cn．

數字出版日期：2015-04-14數字出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/13.1208.T.20150414.0915.001.htm l