ANGPTL3與整合素β3在腎病大鼠足細胞共定位關系的研究

高 霞雷曉燕▲陳軍輝崔維靜羅 璇劉姝嬈索艷紅.甘肅省人民醫院兒科，甘肅蘭州70000；.甘肅省中醫藥大學研究生處，甘肅蘭州70000；.寧夏醫科大學研究生學院，寧夏銀川75000

ANGPTL3與整合素β3在腎病大鼠足細胞共定位關系的研究

高 霞1雷曉燕1▲陳軍輝1崔維靜1羅 璇1劉姝嬈2索艷紅3
1.甘肅省人民醫院兒科，甘肅蘭州730000；2.甘肅省中醫藥大學研究生處，甘肅蘭州730000；3.寧夏醫科大學研究生學院，寧夏銀川750001

[摘要]目的 本研究旨在了解ANGPTL3分子在腎病大鼠足細胞分布情況基礎上，探討ANGPTL3與整合素β3在足細胞分布關系。 方法 分組：正常SD大鼠20只和36只阿霉素腎病大鼠。腎病大鼠在造模第0天一次性尾靜脈注射阿霉素7mg/kg造模。膠體金標記ANGPTL3檢測正常及腎病大鼠足細胞ANGPTL3，電鏡下觀察膠體金顆粒在足細胞的分布特點。免疫熒光雙標法進一步分析腎小球整合素β3與ANGPTL3的共定位情況。 結果 （1）阿霉素造模后第14天SD大鼠開始檢出蛋白尿，至造模第28天蛋白尿達峰值，血脂升高顯著，符合腎病特點。（2）正常大鼠腎小球幾乎不表達ANGPTL3膠體金顆粒，僅在部分足細胞胞漿中可見少量表達。腎病大鼠腎小球膠體金顆粒特異表達在足細胞，但系膜細胞及內皮細胞均未見表達。高倍鏡下觀察可見，膠體金顆粒在腎病足細胞的足突部存在顯著高表達，而在足體及突起部無明顯表達。（3）熒光顯微鏡下可見ANGPTL3與整合素β3的熒光信號均主要集中于腎小球足細胞，分析顯示良好重合現象，提示二者在足細胞有共同的亞細胞定位。 結論 ANGPTL3在阿霉素腎病大鼠中存在高表達，主要表達在足細胞的足突部位，該分子的在足細胞的表達部位與整合素β3存在重合情況。

[關鍵詞]血管生成素樣蛋白3；整合素β3；足細胞

蛋白尿是腎小球功能損傷時預后不良和病情進展的重要因素，足細胞損傷近年來被認為是導致大量蛋白尿發生的關鍵環節，足細胞損傷的相關分子機制研究一直方興未艾[1]。研究發現，血管生成素家族成員與足細胞損傷關系密切，有關該家族成員與腎臟病的研究正成為新的研究熱點[2-3]。血管生成素樣蛋白3（angiopoietin like 3，ANGPTL3）是血管生成素家族的新成員，具有抑制脂酶活性，參與血管新生等多樣功能[4]，最近還發現該蛋白與腎病蛋白尿的發生有關[5-7]。

早期的研究認為ANGPTL3是孤兒配體，最近的研究顯示ANGPTL3能夠結合內皮細胞表面的整合素β3[8]。整合素β3是重要的粘附分子，其活化被看做是足細胞發生活動力升高及蛋白尿發生的關鍵信號事件[9]。動物模型是研究疾病機制的重要載體。有關大鼠足細胞中ANGPTL3的分布情況，及與潛在受體整合素β3的分布關系目前缺乏報道。本實驗通過免疫電鏡技術了解腎病大鼠足細胞ANGPTL3的分布特點，進而分析ANGPTL3與整合素β3在大鼠足細胞的定位關系，以期為今后開展ANGPTL3在大鼠腎病模型的信號機制研究提供分子病理學依據。

1 材料與方法

1.1材料

SD雄性大鼠，來自蘭州大學醫學院動物實驗室，品系為Sprague Dawleyd大鼠，體重95～105g，分組：正常SD大鼠20只和36只阿霉素腎病大鼠。腎病大鼠在造模第0天一次性尾靜脈注射阿霉素7mg/kg，每周檢測一次24h尿蛋白含量，在造模后第28天捕殺模型大鼠進行血腎功能檢測同時取腎組織進行免疫電鏡，普通透射電鏡和光鏡等相關實驗。

福爾馬林及戊二醛來自Sigma公司，鹽酸阿霉素來自Pfizer Inc公司，抗ANGPTL3抗體購買自R&D公司，抗Integrin β3單克隆抗體購自BD公司。

1.2組織處理

實驗中所有腎組織根據檢測目的不同分別給予以下3種處理：10%福爾馬林固定過夜后再用梯度酒精脫水處理，石蠟包埋切片進行光鏡分析；2.5%戊二醛處理后，鋨酸液固定切片，普通透射電鏡檢查；PLP處理大鼠腎組織，振蕩切片后進行免疫電鏡分析。

1.3免疫電鏡

按照山洪災害防治縣級非工程措施建設思路，項目建設任務主要包括8個方面：山洪災害普查；劃定危險區；編制基層防御預案；確定臨界雨量、水位等預警指標；建設雨水情監測站點；配備預警設施；建設縣級監測預警平臺；建立群測群防體系，落實基層責任制，開展宣傳培訓演練。

使用PLP液對新鮮標本在冰點溫度下處理6h，在震蕩切片機上將處理后的大鼠腎組織切割成40μm的組織片，再使用PBS對組織片洗脫3次。洗脫后，繼續在冰點條件下使用0.015%的皂角素浸泡20min，浸泡后PBS洗脫。以PBS代替一抗組為陰性對照，ANGPTL3多克隆抗體以1∶10滴度處理標本。將抗體處理的標本在4℃冰箱中過夜72h。一抗處理結束后PBS洗脫，使用兔抗山羊并偶聯膠體金顆粒（直徑=10nm）的二抗以1∶20滴度繼續處理18h（4℃）。二抗處理結束后，常規電鏡操作步驟處理標本至中性樹脂包埋及標本微切割上機觀察。電鏡下，選取在×7000～40000不同放大倍數條件下觀察腎小球不同區域，以及足細胞不同亞細胞結構域中的金顆粒分布情況。

1.4免疫熒光雙標記

將阿霉素腎病大鼠及正常大鼠腎組織快速冰凍切片，經丙酮處理5min，再PBS洗脫3次后滴加正常兔血清在37℃溫箱處理20min封閉交叉抗原。首先腎組織切片1∶50滴度的ANGPTL3多克隆抗體4℃冰箱過夜，次日予PBS洗脫后，FITC標記的1∶100滴度兔抗羊IgG繼續37℃溫箱處理1h；繼續PBS洗脫，羊血清封閉標本并37℃溫箱20min；除去反應后的羊血清，對標本予抗CD61（整合素β3）單克隆抗體滴度1∶100，37℃溫箱處理1h，PBS洗脫后滴加Rhodamin標記的羊抗鼠IgG二抗（1∶100），37℃溫箱繼續處理1h；PBS洗脫后，緩沖甘油封片，免疫熒光顯微鏡下讀片拍照。

1.5統計學分析

2 結果

2.1腎病大鼠模型基本情況

SD大鼠在7mg/kg阿霉素一次性注射后，一般生長狀態較差，皮毛粗糙伴有脫毛，飲食較差，活動力下降，檢測注射第7天現24h尿蛋白定量已高于正常值，第14天尿蛋白/肌酐大于2.0，符合大量蛋白尿診斷；對照組大鼠生長發育良好，尿蛋白檢測正常。在造模第28天尿蛋白/肌酐達到峰值（24.5±6.7），在第35天開始出現明顯下降，提示阿霉素一次性注射的腎病模型具有尿蛋白自行緩解的趨勢。對大鼠抽取尾靜脈血檢測肝腎功能，發現甘油三酯水平在第14開始升高（6.12±2.12）mmol/L，第28天同樣達到最高值（9.77±4.15）mmol/L，但在第35天無顯著下降趨勢（8.92±3.57）mmol/L。進一步取大鼠腎組織病理檢查發現，7mg/kg阿霉素造模的SD大鼠腎小球在光鏡下無明顯病理損傷改變，電鏡下可見足細胞廣泛足突融合發生和部分微絨毛增生，基本符合人類腎病微小病變病的病理改變特點。具體數值見表1。

2.2ANGPTL3在正常及腎病SD大鼠足細胞的分布及變化特點

免疫電鏡技術作為免疫組化和普通投射電鏡技術相結合的產物，技術難度較大，但其在電鏡下對膠體金的觀察能夠可靠的確定觀察的靶分子的確切亞細胞定位，一直被作為分子病理學研究的重要工具。本研究對造模成功的腎病SD大鼠采用經典的免疫電鏡技術處理后，在不同放大倍數（×7000～40000）下觀察大鼠腎小球足細胞，發生阿霉素處理后的足細胞足突部位均發生不同程度的廣泛融合，以金顆粒標記的靶分子ANGPTL3在腎小球的表達有高度的特異性：即僅表達于足細胞，在系膜細胞和內皮細胞均無表達。同時我們觀察到，膠體金顆粒不僅密集分布于足細胞，還在同一部位的基底膜中有彌散分布。同時，在一例腎病腎小球中，發現金顆粒沿基底膜的內皮細胞側線性沉積。

進一步亞細胞定位研究發現，膠體金顆粒在足細胞內，集中分布在足突的突起部位；在足細胞的其他部位，如胞體和胞突部位分布很少。對不同足突融合程度腎病大鼠，足細胞足突膠體金顆粒的計數分析顯示，足突融合程度為50%的大鼠足細胞膠體金顆粒的表達量（1.05±0.47）金顆粒/μm遠低于足突融合80%的大鼠足細胞膠體金顆粒的數量（2.15±0.65）金顆粒/μm（P＜0.01），足細胞的金顆粒數與足突發生融合的程度有關。與正常大鼠足細胞相比，金顆粒數在腎病足細胞存在顯著升高的現象；亞細胞定位方面，正常足細胞金顆粒主要集中在胞體部而非足突部。

2.3整合素β3與ANGPTL3在腎病大鼠腎小球的共定位情況

根據電鏡觀察結果， ANGPTL3在足細胞的定位特點與已報道的整合素β3在腎小球的分布相似，即主要集中在足突部位，在腎小球的其他細胞無表達。故本部分實驗重點觀察了這2個分子免疫熒光信號在足細胞是否存在重合。在熒光顯微鏡下，觀察到FITC標記（綠色熒光）的ANGPTL3 與Rhodamin（紅色熒光）標記的整合素β3的熒光信號均在足細胞區域有較強熒光信號，進一步使用軟件Merge處理后，提示2個熒光信號疊加后呈黃色信號，提示二者有較好的重合效應，半定量分析顯示，每份腎病大鼠腎小球ANGPTL3與整合素β3的熒光信號（+++～++++）均與顯著強于正常大鼠表達量（+～++）的趨勢。

表1　阿霉素腎病大鼠血生化指標特點（±s）

表1　阿霉素腎病大鼠血生化指標特點（±s）

時間　　組別　　白蛋白（g/L）　　膽固醇（mmol/L）　　甘油三酯（mmol/L）　尿素氮（mmol/L）　肌酐（μmol/L）第0天　　實驗組　27.4±3.72　2.17±0.54　0.77±0.43　9.28±1.65　20.54±4.17對照組　29.14±3.05　1.82±0.57　0.54±0.28　11.23±4.15　22.39±3.58 t 0.33　0.57　0.71　0.59　0.65 P ＞0.05　　＞0.05　　＞0.05　　＞0.05　　＞0.05 第14天　　實驗組　18.22±2.74　3.72±1.33*　6.73±2.86　8.94±3.62　24.15±4.26對照組　32.18±3.26　1.64±0.43　1.36±0.65　9.75±3.17　20.03±5.17 t 2.38　3.27　3.91　0.62　0.69 P ＜0.05　　＜0.05　　＜0.01　　＞0.05　　＞0.05 第28天　　實驗組　15.93±2.37　5.46±1.97　12.17±5.43　7.14±2.31　26.83±6.74對照組　34.19±3.67　1.69±0.38　1.08±0.33　8.23±1.75　24.57±5.83 t 2.95　4.18　4.92　0.56　0.35 P ＜0.05　　＜0.01　　＜0.01　　＞0.05　　＞0.05

3 討論

近年來針對ANGPTL3的研究主要集中在脂代謝領域，認為該分子是參與脂質代謝的關鍵調控因素[10-12]。我們研究小組近些年在腎病綜合癥患兒的研究中發現，ANGPTL3不僅在腎病患兒體內存在高表達，同時還參與足細胞損傷的發生[13]。免疫電鏡技術是研究分子亞細胞定位的關鍵技術，本研究旨在深入分析ANGPTL3在腎病大鼠足細胞的亞細胞定位特點，進而在形態學角度探討其與整合素β3在足細胞的共定位關系，為進一步探討二者的作用特點提供病理學基礎。

本研究以直徑10nm的膠體金顆粒偶聯二抗以顯示ANGPTL3，首次對大鼠腎小球ANGPTL3的表達情況進行了細致觀察。電鏡結果證實，大鼠的足細胞能夠合成ANGPTL3；半定量分析：金顆粒在正常大鼠足細胞微量表達，阿霉素刺激后足細胞的金顆粒數顯著增多，且，金顆粒表達量與足細胞足突融合程度有關。已知，足細胞損傷是大量蛋白尿產生的核心環節，足突融合是足細胞損傷中最常見的病理類型[14-16]。本研究結果提示，ANGPTL3與足細胞損傷呈正相關性，這與已有報道ANGPTL3與腎病患兒蛋白尿水平正相關的研究結果相印證。亞細胞定位證實，足細胞發生損傷時，ANGPTL3在的亞細胞分布也會發生改變，即由正常狀態下的胞體部向足突區域遷移、濃集，說明該分子參與了足細胞損傷的發生。

眾所周知，整合素是參與細胞活化、遷移的重要受體，整合素β3最近被發現在足細胞表達，并參與蛋白尿形成[17-18]。本研究發現，ANGPTL3的足細胞定位與已報道的整合素分子相似[9]。為此，我們繼續探討了2個蛋白是否的確在腎小球足細胞存在共定位可能。結果顯示，在腎病大鼠腎小球ANGPTL3與整合素β3的確存在良好的信號重合現象，說明二者在足細胞具有較好共定位特點，從分子病理角度證實整合素β3可能在足細胞仍是ANGPTL3的受體途徑。

在電鏡觀察中，我們也發現在腎病大鼠足細胞金顆粒在同一血管襻有向基底膜彌散的趨勢。這一現象說明ANGPTL3在足細胞合成后有向細胞外分泌的特點。但，ANGPTL3由足細胞分泌后是否會影響濾過屏障內皮細胞功能尚缺乏報道，需要繼續深入研究。

腎病綜合征是兒童最常見的腎臟疾病之一，探討其發病機制，發現新的更有效的治療藥物是兒童腎臟病領域長期以來的重要問題。ANGPTL3在腎臟足細胞的深入研究將為今后的腎病分子治療提供新的解決思路和靶點[19]。

[參考文獻]

[1] Ruggenenti P，Remuzzi G.Time to abandon microal buminuria[J].Kidney Int，2006，70（7）：1214-1222.

[2] Brown LF，Berse B，Tognazzi K，et al.Vascular permeability factor mRNA and protein expression in human kidney[J].Kidney Int，1992，3（42）：1457-1461.

[3] Simon C.Human Podocytes Express angiopoietin 1，a potential regulator of glomerular vascular endothelial growth factor[J].J Am Soc Nephrol，2002，13（12）：544-550.

[4] Shimizugawa T，Ono M，Shimamura M，et al.ANGPTL3 decreases very low density lipoprotein triglyceride clearance by inhibition of lipoprotein lipase[J].J Biol Chem，2002，277（37）：33742-33748.

[5] 饒佳，徐虹.兒童原發性腎病綜合征中血管生成素樣蛋白3的表達[J].中華腎臟病雜志，2006，22（5）：286-290.

[6] Gao X，Xu H，Liu H，et al.Angiopoietin-like protein 3 regulates the motility and permeability of podocytes by altering nephrin expression in vitro[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，399（1）：31-36.

[7] Liu H，Gao X，Xu H，et al.α-Actinin-4 is involved in the process by which dexamethasone protects actin cytoskeleton stabilization from adriamycin-induced podocyte injury[J]. Nephrology（Carlton），2012，17（8）：669-675.

[8] Camenisch G，Pisabarro MT，Sherman D，et al.ANGPTL3 stimulates endothelial cell adhesion and migration via integrin alpha vbeta 3 and induces blood vessel formation in vivo[J].J Biol Chem，2002，277（19）：17281-17290.

[9] Wei CL，Moller CC.Modification of kidney barrier function by the uroki -nase receptor[J].Nat Med，2008，14（2）：55-63.

[10] Arca M1，Minicocci，Maranghi M.The angiopoietin-like protein 3：a hepatokine with expanding role in metabolism[J]. Curr Opin Lipidol，2013，24（4）：313-320.

[11] Gieri Camenisch，Maria Teresa.ANGPTL3 stimulates endothelial cell adhesion and migration via integrin αVβ3 and induces blood vessel formation in vivo[J].J Biol Chem，2000，19（277）：17281-17290.

[12] Koishi R，Ando Y.Angptl3 regulates lipid metabolism in mice[J].Nature Genetics，2002，12（30）：151-157.

[13] Liu J，Gao X，Zhai Y，et al.A novel role of angiopoietinlike-3 associated with podocyte injury[J].Pediatr Res，2015，24（10）：8.

[14] Peter GT.Are podocytes passive or provocative in proteinuric glomerular pathology?[J].JAm Soc Nephrol，2008，19（8）：649-655.

[15] Liao R，Liu Q，Zheng Z，et al.Tacrolimus protects podocytes from injury in lupus nephritis partly by stabilizing the cytoskeleton and inhibiting podocyte apoptosis[J].PLoS One，2015，10（7）：10.

[16] Cellesi F，Li M，Rastaldi MP.Podocyte injury and repair mechanisms[J].Curr Opin Nephrol Hypertens，2015，24 （3）：239-244.

[17] Zhang B，Shi W，Ma J，Sloan A，et al.The calcineurin-NFAT pathway allows for urokinase receptor-mediated beta3 integrin signaling to cause podocyte injury[J].J Mol Med（Berl），2012，90（12）：1407-1420.

[18] Huang J，Liu G，Zhang YM，et al.Urinary soluble urokinase receptor levels are elevated and pathogenic in patients with primary focal segmental glomerulosclerosis[J].BMC Med，2014，20（12）：81.

[19] Naoumova RP，Betteridge DJ，et al.A new drug target for treatment of dyslipidaemia associated with type 2 diabetes and the metabolic syndrome?[J]Lancet，2002，29（359）：2215-2216.

[中圖分類號]R692

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2015）23-24-04

[基金項目]國家自然科學基金地區項目（81360114）；甘肅省科技廳科技攻關項目（1305TCYA035）；甘肅省隴原青年創新人才扶持計劃，甘組通字[（2014）4號]。

收稿日期：（2015-08-04）

Research on co-localization of ANGPTL3 and integrinβ3 in podocyte of nephropathy rats

GAO Xia1LEI Xiaoyan1CHEN Junhui1CUI Weijing1LUO Xuan1LIU Shurao2SUO Yanhong3
1.Department of Pediatrics, Gansu People's Hospital, Lanzhou 730000, China; 2.Department of Postgraduate, Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 3.School of Postgraduate, Ningxia Medical University, Yinchuan 750001, China

[Abstract]Objective To explore distribution relation of ANGPTL3 molecular and integrinβ3 in podocyte at the basis of knowing the distribution of ANGPTL3 in podocyte of nephropathy rats. Methods Groups: 20 normal SD rats and 36 adriamycin nephropathy rats. Nephropathy rats were received tail vein injection of 7mg/kg of adriamycin at one time to make models at the zero day of modeling. ANGPTL3 was marked by colloidal gold and podocyte of normal rats and nephropathy rats were detected. Distribution feature of colloidal gold particle in podocyte were observed under electron microscope. Colocalization of glomerular integrinβ3 and ANGPTL3 were further analyzed by double immunofluorescent staining. Results (1)At the 14th day of modeling of adriamycin, proteinuria was detected in SD rats and proteinuria got to the maximum at the 28th day of modeling. Rising of blood lipid was significant which accords with nephropathy features. (2) Glomerular of normal rats nearly don't express ANGPTL3 colloidal gold particle and few expressions only can be seen in parts of podocyte cytoplasm. Glomerular colloidal gold particles of nephropathy rats were specifically expressed in podocyte which were not expressed in mesangial cells and endothelial cells. By the observation under high power lens, it can be seen that colloidal gold particles were significantly highly expressed in foot processes which were not significantly highly in podosoma and processes. (3) Under fluorescence microscope, fluorescence signals of ANGPTL3 and integrinβ3 were both mainly distributed in glomerular podocyte. Analysis showed good coincidence phenomenon, which suggested that ANGPTL3 and integrinβ3 had common subcellular localization in podocyte. Conclusion ANGPTL3 is highly expressed in adriamycin nephropathy rats, mainly in foot process. Expression positions in podocyte of this molecular and integrinβ3 have coincidence phenomenon.

[Key words]Angiopoientin-like protein; Integrinβ3; Podocyte