黃芩素對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及小鼠血清VEGF，TNF-α水平的影響

宋紅群王 寧張延新.安鋼職工總醫(yī)院功能檢查科，河南安陽(yáng) 455004；.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南漯河 46000

黃芩素對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及小鼠血清VEGF，TNF-α水平的影響

宋紅群1王 寧2張延新2
1.安鋼職工總醫(yī)院功能檢查科，河南安陽(yáng) 455004；2.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南漯河 462000

[摘要]目的 觀察黃芩素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480移植瘤的生長(zhǎng)及小鼠血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的影響。 方法 通過裸鼠前肢腋窩皮下移植的方法構(gòu)建SW480細(xì)胞移植瘤模型成功后，用不同濃度的黃芩素通過灌胃給藥的方式進(jìn)行處理，14d后觀察小鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況，計(jì)算腫瘤抑制率，取胸腺和脾臟計(jì)算臟器指數(shù)，并測(cè)定小鼠血清中VEGF, TNF-α的水平。 結(jié)果 黃芩素高、中、低劑量處理組相對(duì)于模型組，腫瘤抑制率分別為46.2%，31.3%，15.2%。高、中劑量黃芩素處理組的臟器指數(shù)顯著高于模型組（P＜0.05）。高劑量黃芩素處理組血清VEGF水平明顯低于模型組（P＜0.05），血清TNF-α水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 黃芩素能抑制SW480移植瘤的生長(zhǎng)，其可能是通過調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能及影響VEGF的表達(dá)來發(fā)揮其抗腫瘤活性。

[關(guān)鍵詞]黃芩素；結(jié)腸癌；SW480細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α

結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）是發(fā)生于世界范圍的常見惡性腫瘤之一，尤其是歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，其已經(jīng)成為惡性腫瘤高死亡率發(fā)生的主要原因之一[1-3]。越來越多的證據(jù)表明，結(jié)腸癌是臨床最常診斷出的癌癥，并已成為癌癥死亡的第二大原因[3]。在我國(guó)，結(jié)腸癌已成為一種高發(fā)病率及高死亡率的惡性腫瘤[4]。黃芩素是傳統(tǒng)中藥黃芩中存在的一類黃酮類化合物，其具有抗氧化、抗腫瘤等作用[5-9]。本研究以人結(jié)腸癌結(jié)腸癌細(xì)胞SW480移植小鼠為對(duì)象，觀察黃芩素對(duì)SW480荷瘤小鼠生長(zhǎng)以及小鼠血清VEGF，TNF-α水平的影響，探討黃芩素的抗腫瘤活性以及其對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

來源于人結(jié)腸低分化黏液腺癌細(xì)胞系SW480購(gòu)置于上海生物研究所。BALB/c裸小鼠52只，4～5周齡，雌雄各半，體重（20±2）g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)SCXK（豫）2005-008。

1.2藥品與試劑

VEGF， TNF-α ELISA試劑盒（美國(guó)ScienCell）， 小牛血清，DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco），黃芩素（美國(guó)Sigma）。

1.3 儀器

BT25S精密電子天平（德國(guó)賽多利斯公司），ELx808IUTM光吸收酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰公司），MSE- 25型高速冷凍離心機(jī)（上?？茖W(xué)儀器廠），ThermoForma702超低溫冰箱（美國(guó)博樂公司）。

1.4方法

1.4.1移植瘤模型的構(gòu)建 將SW480細(xì)胞置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，環(huán)境溫度37℃，CO2濃度為5%。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×107/mL，混勻，于小鼠前肢腋窩皮下注射0.2mL的細(xì)胞懸液。獨(dú)立飼養(yǎng)14d后，注射部位皮下出現(xiàn)結(jié)節(jié)，穩(wěn)定的SW480小鼠移植瘤模型構(gòu)建成功。

1.4.2分組及藥物處理 黃芩素注射液經(jīng)甲醇稀釋配制成終濃度分別為20μg/mL，50μg/mL，100μg/mL的工作液備用。將移植成功SW480的BALB/c小鼠隨機(jī)分成模型組、黃芩素高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組13只小鼠，按小鼠體重5mL/20g劑量經(jīng)灌胃分別給予0.9%生理鹽水，20μg/mL，50μg/mL，100μg/mL黃芩素工作液。連續(xù)給藥14d。觀察各組實(shí)驗(yàn)對(duì)象的活動(dòng)情況及生存狀態(tài)。

1.4.3檢測(cè)血清VEGF，TNF-α水平 末次給藥24h之后，稱重記錄，然后摘除眼球取血，靜置60min，1000×g離心20min，取上清液，采用ELASA法檢測(cè)血清中VEGF，TNF-α水平。

1.4.4測(cè)量腫瘤體積及質(zhì)量 取血后處死小鼠，解剖剝離瘤快，經(jīng)生理鹽水清洗，濾紙吸干后稱重并記錄。按平均瘤質(zhì)量計(jì)算抑瘤率：抑瘤率（%）=（模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），并計(jì)算腫瘤的體積：V=1/2ab2（mm3）。

1.4.5計(jì)算臟器指數(shù) 小鼠取血?jiǎng)冸x瘤快后，取胸腺、脾臟稱重記錄，按照臟器指數(shù)公式計(jì)算相應(yīng)的脾臟、胸腺指數(shù)：臟器指數(shù)（mg/g）=臟器質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果

2.1各組腫瘤生長(zhǎng)情況比較

處死小鼠，剝?nèi)×隹?，?jīng)清洗處理后，測(cè)量瘤體積及質(zhì)量（表1）。與模型組比較，經(jīng)中、高劑量黃芩素處理的各組瘤體積均顯著減少（P＜0.05），低劑量黃芩素處理組的瘤質(zhì)量減少（P＜0.05），中劑量、高劑量組則顯著減少（P＜0.05），根據(jù)抑瘤率計(jì)算公式，高、中、低劑量黃芩素處理組的抑瘤率分別為35.88%、25.04%、16.16%。

表1　黃芩素對(duì)各組小鼠皮下SW480移植瘤生長(zhǎng)情況影響比較（±s）

表1　黃芩素對(duì)各組小鼠皮下SW480移植瘤生長(zhǎng)情況影響比較（±s）

注：*與模型組比較

組別　n　　瘤體積（ mm3）　t （P）*　　瘤質(zhì)量（g）　t （P）*　　抑瘤率（%）模型組　13　511.0±43.7　0.563±0.057黃芩素-低　13　475.0±56.2　1.82（0.081）　0.472±0.106　2.72（0.012）　16.16黃芩素-中　13　428.0±84.1　3.16（0.004）　0.422±0.113　4.01（0.000）　25.04黃芩素-高　13　361.0±41.0　9.03（0.000）　0.361±0.070　8.06（0.000）　35.88

2.2各組臟器指數(shù)情況比較

臟器指數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示，與模型組比較，經(jīng)高、中、低劑量黃芩素處理的三組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有所提高，但低劑量組提高不明顯，中劑量組、高劑量組有顯著提高（P＜0.05）。見表2。

表2　黃芩素對(duì)各組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)影響比較（±s）

表2　黃芩素對(duì)各組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)影響比較（±s）

注：*與模型組比較

組別　n　　體質(zhì)量（g）　　脾臟指數(shù) （mg/g）　t （P）*　　胸腺指數(shù)（mg/g）　t （P）*模型組　13　24.97±1.56　2.24±0.41　2.88±0.61黃芩素-低　13　26.84±1.46　2.52±0.33　1.92（0.067）　3.28±0.47　1.87（0.073）黃芩素-中　13　27.19±2.08　3.17±0.45　5.51（0.000）　3.78±0.38　4.51（0.000）黃芩素-高　13　27.02±1.21　3.49±0.39　7.96（0.000）　4.35±0.67　5.84（0.000）

2.3各組血清VEGF，TNF-α水平比較

與模型組比較，低劑量黃芩素處理組小鼠血清VEGF水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中、高劑量黃芩素處理組小鼠血清VEGF水平顯著降低（P＜0.05）。高劑量黃芩素經(jīng)消化道給藥后能夠提高小鼠血清TNF-α的水平，與模型組相比較差異顯著（P＜0.05），具體結(jié)果見表3。

表3　黃芩素對(duì)各組小鼠血清VEGF，TNF-α水平影響比較（±s）

表3　黃芩素對(duì)各組小鼠血清VEGF，TNF-α水平影響比較（±s）

注：*與模型組比較

組別　n　VEGF（pg/mL）　t（P）*　TNF-α（pg/mL）　t（P）*模型組　13　418.6±22.1　34.28±17.17黃芩素-低　13　409.5±19.9　1.10（0.281）　41.13±36.02　0.62（0.542）黃芩素-中　13　376.1±56.3　2.53（0.018）　59.64±42.81　1.98（0.059）黃芩素-高　13　331.6±42.4　6.56（0.000）　70.82±36.65　3.26（0.003）

3 討論

結(jié)腸癌病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，年齡、環(huán)境、遺傳及飲食等因素均是其發(fā)生的危險(xiǎn)因素，然而目前我們對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生的具體病因和詳細(xì)機(jī)制知之甚少。傳統(tǒng)的治療方案包括放射治療、化學(xué)藥物治療及手術(shù)治療在內(nèi)，對(duì)結(jié)腸癌的治療效果并不理想，因此需要進(jìn)一步開發(fā)包含生物治療在內(nèi)的綜合治療方案來進(jìn)一步降低直腸癌死亡率。

中藥輔助治療癌癥的研究是目前的前沿?zé)衢T研究。已有研究表明多種中草藥有效提取物能夠通過不同的途徑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10-12]。黃酮類化合物是存在于植物、水果等常見植物體內(nèi)的一類化合物，具有顯著的抗炎、抗氧化及抗癌特性。黃芩素就屬于該類化合物。

已有研究表明黃芩素能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[13]，通過抑制胃癌細(xì)胞VEGF 和HGF的表達(dá)來抑制胃癌的增殖[14]。本研究表明黃芩素能夠明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480移植瘤的生長(zhǎng)，這種抑制表現(xiàn)在瘤體積和瘤質(zhì)量?jī)蓚€(gè)方面，并隨著劑量的增加腫瘤生長(zhǎng)抑制率逐漸升高。

黃芩素除了影響移植瘤的生長(zhǎng)外，我們的研究還表明黃芩素可能影響荷瘤小鼠的免疫功能。與模型組相比較，中高劑量黃芩素處理的小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)升高，高劑量黃芩素處理的小鼠血清TNF-α水平增加，提示黃芩素可能具有調(diào)節(jié)免疫的作用，進(jìn)而間接發(fā)揮抗腫瘤作用。

血管生成是實(shí)體瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，是腫瘤生長(zhǎng)的基礎(chǔ)[15]。 血管生成受到血管生成因子和血管生成抑制因子兩方面的調(diào)控，其中，VEGF是作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生成調(diào)控因子[16]。VEGF及VEGFR在多種腫瘤組織的表達(dá)明顯高于正常組織，且與腫瘤組織血管密度正相關(guān)[17]。VEGF一方面可以通過與腫瘤細(xì)胞表面的受體結(jié)合，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，另一方面還能與腫瘤周圍的脈管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，調(diào)節(jié)血管和淋巴管的生成，增加其通透性，有利于腫瘤的生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[18]。本研究中，高劑量黃芩素組處理的荷瘤小鼠血清VEGF水平顯著降低，提示黃連素可能會(huì)通過影響VEGF的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的生長(zhǎng)與發(fā)展。

本研究表明黃芩素能夠抑制體內(nèi)結(jié)腸腫瘤的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出抗腫瘤活性，其可能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫功能及影響VEGF的表達(dá)來抑制腫瘤的生長(zhǎng)。結(jié)腸癌的病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，需要通過進(jìn)一步研究來揭示其發(fā)生的詳細(xì)機(jī)制。

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[中圖分類號(hào)]R735.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-0616（2015）23-28-04

[基金項(xiàng)目]河南省教育廳青年教師資助項(xiàng)目（2012GGJS-269）。

收稿日期：（2015-08-10）

The effect of baicalein on growth of human colonic cancer cells and the levels of serum VEGF, TNF-α in nude mice

SONG Hongqun1WANG Ning2ZHANG Yanxin2
1.Angang General Hospital, Anyang 455004, China; 2. Department of Basic Medical Science, Luohe Medical College, Luohe 462000, China

[Abstract]Objective To observe the effect of baicalein on grouth of human colonic cancer cell line SW480 in nude mice and the levels of serum VEGF and TNF-α in nude mice dealt with baicalein. Methods Transplanted colonic cancer models with SW480 cell line were established by subcutaneous injections at armpit of forelimb in nude mice. Then the nude mice were dealt with different levels of baicalein. After 14 days, we observed the growth of the tumor, calculated the growth inhibiting rate of tumor, spleen index and thymus index, and detected the levels of serum VEGF and TNF-α in nude mice. Results The growth inhibiting rates of tumor in groups dealt with high, middle and low dosage of baicalein separately were 46.2%, 31.3%, 15.2%. Organ index in groups dealt with high and middle dosage of baicalein were higher than model group (P＜0.05). In group dealt with high dosage of baicalein, the serum level of VEGF was significantly lower than model group (P＜0.05), and serum TNF-α level was higher than model group (P＜0.05). Conclusion Baicalin may inhibit the growth of SW480 cells in nude mice, and the functions could be played by regulating immune responses and influence the expression of VEGF in mice.

[Key words]Baicalein; Colonic neoplasms; SW480; VEGF; TNF-α