caspase-3表達與血管內皮細胞凋亡在子癇前期發病機制中的作用

李延輝梁媚珍蔣潔珊.廣東省東莞市石碣醫院病理科，廣東東莞590；.廣東省東莞市石碣醫院婦產科，廣東東莞590；.廣東省東莞市石碣醫院手術室，廣東東莞590

caspase-3表達與血管內皮細胞凋亡在子癇前期發病機制中的作用

李延輝1梁媚珍2蔣潔珊3
1.廣東省東莞市石碣醫院病理科，廣東東莞523290；2.廣東省東莞市石碣醫院婦產科，廣東東莞523290；3.廣東省東莞市石碣醫院手術室，廣東東莞523290

[摘要]目的 探討子癇前期患者胎盤組織中血管內皮細胞凋亡及凋亡相關基因caspase-3表達的關系。 方法 選擇我院住院治療的子癇前期孕婦45例為觀察組，正常孕婦45例為對照組。收集兩組的胎盤組織標本，采用免疫組化法檢測兩組胎盤組織中凋亡相關基因caspase-3的表達，并應用TUNEL方法檢測胎盤血管內皮細胞的凋亡情況。 結果 觀察組胎盤血管內皮細胞AI為（0.89%±0.08%），對照組胎盤血管內皮細胞AI為（0.28%±0.04%）。兩組的胎盤組織中血管內皮細胞AI比較，觀察組AI顯著高于對照組，差異有統計學意義（t=7.59，P＜0.05），隨病情加重，輕度子癇前期組、重度子癇前期組血管內皮細胞AI呈上升趨勢，其值分別為（0.76%±0.06%），（1.04%±0.02%），兩組之間比較，差異有統計學意義（t=6.29， P＜0.05）。觀察組胎盤血管內皮細胞中caspase-3蛋白的陽性表達率為62.2%，而對照組胎盤血管內皮細胞中caspase-3蛋白的陽性表達率為4.4%，觀察組顯著高于對照組，差異有統計學意義（x2=11.65，P＜0.01）。輕度子癇前期組、重度子癇前期組胎盤血管內皮細胞中caspase-3蛋白表達呈上升趨勢，兩組之間比較，差異有統計學意義（x2=9.91，P＜0.01）。 結論 胎盤血管內皮細胞凋亡及caspase-3表達上調在子癇前期的形成過程中起重要作用。

[關鍵詞]子癇前期；caspase-3；血管內皮細胞；凋亡

子癇前期是妊娠期特有的疾病，可累及全身多器官功能損害或功能衰竭，嚴重影響母嬰健康。子癇前期的發病機制多年來一直是產科界研究的熱點問題，但迄今為止其病因仍未明確[1]。因此，明確其發病機制，采取有效的預防治療措施，降低孕產婦、圍生兒死亡率，改善其預后，已成為一項十分有益的課題。目前許多研究普遍認為，血管內皮細胞受損、結構及功能發生改變，甚至發生凋亡，是子癇前期發病至關重要的環節[2]。目前細胞凋亡分子生物學研究發現caspase（cysteinyl aspartate specific proteinase，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）家族參與了凋亡的調控過程，其中caspase-3 是caspase家族中參與細胞凋亡調控的關鍵蛋白酶[3-4]。本研究通過應用免疫組織化學方法（SP法）及TUNEL法[terminal dexynucleotidyl transferase （TdT）-mediated Dutp nick end labeling]，脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法）檢測45例子癇前期患者的胎盤組織中血管內皮細胞凋亡情況及caspase-3的表達，旨在進一步探討子癇前期患者胎盤血管病變發生機制，為其治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇于我院住院治療的子癇前期孕婦45例為觀察組（輕度子癇前期21例，重度子癇前期24例），正常孕婦45例為對照組，均為剖宮產終止妊娠，子癇前期診斷標準參考第6版《婦產科學》[5]，排除有多胎妊娠、高血壓、心臟病、腎臟病、慢性肝病等病史以及輸血和免疫治療史的病例。兩組的年齡、孕周等一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。收集兩組的胎盤組織標本，避開出血、壞死及鈣化區，均置入10%中性緩沖甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋，連續切片，厚度約3μm。

1.2主要試劑

SP法（streptavidin-perosidase，兩步法）試劑盒購自福建邁新生物技術有限公司，caspase-3山羊抗人多克隆抗體（工作濃度1∶50）均購自美國cell signal公司。TUNEL檢測細胞凋亡試劑盒購自德國Boehringer Mannheim公司。

1.3方法

1.3.1TUNEL方法檢測胎盤血管內皮細胞的凋亡 常規石蠟切片置于60℃烤箱內烘干60min，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。新鮮配制3% H2O2滅活處理，新鮮稀釋ProteinaseK 37℃消化，加TUNEL反應液（含TdT和Bio-21-dUTP），置濕盒37℃標記2h，加封閉液50μL/片，甩掉封閉液，加入1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，濕盒37℃ 30min，最后加入1∶100稀釋SABC，濕盒37℃ 30min。0.01mol/L TBS洗4次后DAB顯色，蘇木素輕度復染，水洗，脫水，透明，封片，光鏡下觀察。結果判定：光鏡下凋亡細胞核呈棕黃色，高倍鏡（放大400倍）下隨機觀察10個不同視野，算出血管內皮細胞凋亡指數（apoptosis index，AI），AI=血管內皮細胞染色陽性細胞數/血管內皮細胞總數×100%。

1.3.2免疫組織化學染色 采用免疫組化SP法檢測兩組胎盤血管內皮細胞中caspase-3的表達。操作程序：石蠟切片置于60℃烤箱內烘干60min，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，緩沖液沖洗。將切片采用微波爐行抗原修復，置于3% H2O2滅活內源性過氧化氫酶，滴加封閉用正常山羊血清工作液，37℃溫箱孵育。caspase-3抗體按 1∶100稀釋，滴加稀釋的caspase-3工作液，濕盒4℃過夜。緩沖液沖洗后滴加Ⅱ抗工作液，濕盒37℃孵育。滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，濕盒37℃孵育。緩沖液沖洗后采用DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，透明，封片，光鏡下觀察。染色結果判斷：光鏡下顯示caspase-3定位于胞漿和胞膜內，呈黃色或棕色顆粒。每張切片隨機選擇檢查5個視野，計數100個細胞，根據陽性細胞百分率數綜合判定，計數陽性細胞數，計算陽性細胞率。0%～5%為（-）；5%～10%為（+）；20%～35%為（++）；35%～50%為（+++）。（+）～（+++）記為陽性。

1.4統計學方法

應用SPSS13.0版統計軟件進行分析，計數資料采用x2檢驗法，計量資料采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1兩組胎盤血管內皮細胞凋亡情況比較

觀察組胎盤血管內皮細胞AI為（0.89%±0.08%），對照組胎盤血管內皮細胞AI為（0.28%±0.04%）。兩組的胎盤組織中血管內皮細胞AI比較，觀察組AI顯著高于對照組，差異有統計學意義（t=7.59，P＜0.05），隨病情加重，輕度子癇前期組、重度子癇前期組血管內皮細胞AI呈上升趨勢，其值分別為（0.76%±0.06%），（1.04%±0.02%），兩組之間比較，差異有統計學意義（t=6.29，P＜0.05）。見表1。

表1　兩組胎盤血管內皮細胞凋亡情況比較（±s）

表1　兩組胎盤血管內皮細胞凋亡情況比較（±s）

組別　n　　血管內皮細胞AI（%）觀察組　45　0.89±0.08輕度子癇前期　21　0.76±0.06重度子癇前期　24　1.04±0.02對照組　45　0.28±0.04

2.2兩組胎盤血管內皮細胞中caspase-3蛋白表達比較

觀察組胎盤血管內皮細胞中caspase-3蛋白的陽性表達率為62.2%，而對照組胎盤血管內皮細胞中caspase-3蛋白的陽性表達率為4.4%，兩組caspase-3蛋白陽性表達率比較，觀察組顯著高于對照組，差異有統計學意義（x2=11.65，P＜0.01）。隨病情加重，輕度子癇前期組、重度子癇前期組胎盤血管內皮細胞中caspase-3蛋白表達呈上升趨勢，兩組之間比較，差異有統計學意義（x2=9.91，P＜0.01），見表2。

表2　兩組胎盤血管內皮細胞中caspase-3蛋白表達比較

3 討論

子癇前期發病機制尚不清楚，一直是產科領域的研究熱點。現公認為其病理起源為胎盤，其中血管內皮細胞受損、結構及功能發生改變，甚至發生凋亡，是子癇前期發病至關重要的環節[6]。血管內皮細胞為覆蓋于血管內表面的單層扁平上皮細胞，是血管內血液和血管平滑肌之間的重要屏障，具有調節平滑肌張力、屏障作用、免疫功能、合成多種結締組織等功能。血管內皮細胞發生損傷后，細胞間隙被破壞，致使蛋白以及液體更容易滲透出血管，進一步促進凝血系統發生DIC，造成細胞之間聯接被破壞，使血管內蛋白和液體的外滲[7-8]；激活凝血系統造成DIC，激活并釋放血管活性因子和血管收縮因子，同時抑制血管舒張因子的分泌與激活，使機體內血管調節細胞因子失衡，促進血管收縮的因子起主要作用，從而血壓升高，全身各系統各臟器血液灌流量減少，最終導致器官病理改變，出現子癇前期[9-10]，但目前血管內皮細胞受損、結構及功能發生改變，甚至發生凋亡的具體機制仍然不清楚[11]。

本研究采用TUNEL法對子癇前期患者和正常孕婦胎盤血管內皮細胞發生凋亡的情況進行檢測，結果發現子癇前期患者胎盤血管內皮細胞的AI為0.89%，正常孕婦胎盤血管內皮細胞AI為0.28%，子癇前期患者胎盤血管內皮細胞AI顯著高于正常孕婦胎盤血管內皮細胞AI（P＜0.05），說明胎盤血管內皮細胞凋亡可能參與了子癇前期的發生過程。本組研究中發現隨病情加重，輕度子癇前期組、重度子癇前期組血管內皮細胞AI呈上升趨勢（P＜0.05），也進一步驗證了胎盤血管內皮細胞發生凋亡可能與子癇前期的發生和發展過程密切相關。

caspase-3是參與調控凋亡發生的關鍵蛋白酶，細胞在外界各種刺激和誘因作用下，caspase-3被釋放并活化，caspase-3激活后具有切斷肽鍵的作用，致使細胞質、細胞核及細胞骨架的重要蛋白質降解失活，從而誘導凋亡的發生。研究證實，血管內皮細胞的兩條凋亡信號傳導通路最終都是通過激活caspase-3而引起凋亡的。Du HJ等[12]通過體外血管內皮細胞培養實驗發現，在血管內皮細胞凋亡過程中，caspase-3表達量明上調。在Zhao JF等[13]的試驗中發現caspase-3控制的凋亡信號通路是血管內皮細胞發生凋亡的主要作用機制。FarberA等[14]研究應用caspase-3抑制劑作用于體外培養的血管內皮細胞中，發現caspase-3的活性被抑制后，發生凋亡的血管內皮細胞數目減少。尹曉敏等[15]實驗也發現檳榔堿刺激血管內皮血細胞下，caspase-3表達和活性均明顯增高，血管內皮細胞也隨之發生大幅度凋亡。

本研究應用免疫組織化學法觀察子癇前期患者和正常孕婦胎盤血管內皮細胞中caspase-3的表達情況，結果顯示子癇前期患者胎盤血管內皮細胞中caspase-3蛋白的陽性表達率為62.2%，而正常孕婦胎盤血管內皮細胞中caspase-3蛋白的陽性表達率為4.4%，子癇前期患者顯著高于正常孕婦（P＜0.01）。提示caspase-3可能在子癇前期形成過程中發揮著重要作用。隨病情加重，輕度子癇前期組、重度子癇前期組胎盤血管內皮細胞中caspase-3蛋白表達呈上升趨勢（P＜0.01），進一步證實了caspase-3蛋白表達上調可能是子癇前期患者胎盤血管病變發生機制之一。推測caspase-3上調可使血管內皮細胞的胞漿、細胞核及細胞骨架的重要蛋白質降解失活，從而誘導凋亡的發生，因此可以認為caspase-3是血管內皮細胞凋亡的關鍵執行者，他的裂解活化是血管內皮細胞凋亡進入不可逆階段標志[16]。

綜上所述，胎盤血管內皮細胞發生凋亡及caspase-3表達增高在子癇前期的發生發展過程中起重要作用，相信深入探討胎盤血管內皮細胞發生凋亡及caspase-3表達增高的調控機制， 針對caspase-3表達的抑制劑研發及應用，將對減緩子癇前期的形成及發展具有重要的臨床價值，這也將是今后研究的新方向。

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[中圖分類號]R714.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2015）23-31-04

[基金項目]廣東省東莞市醫療衛生科技計劃一般項目（2015105101214）。

收稿日期：（2015-09-15）

Role of caspase-3 expression and vascular endothelial cells apoptosis in the pathogenesis of preeclampsia

LI Yanhui1LIANG Meizhen2JIANG Jieshan3
1.Department of Pathology, Dongguan Shijie Hospital, Dongguan 523290, China; 2 Department of Gynecology and Obstetrics, Dongguan Shijie Hospital, Dongguan 523290, China; 3.The Operating Room, Dongguan Shijie Hospital, Dongguan 523290, China

[Abstract]Objective To explore the correlation of vascular endothelial cells apoptosis and apoptosis-related gene caspase-3 expression in placental tissue of patients with preeclampsia. Methods 45 pregnant women with preeclampsia who were hospitalized in our hospital were selected as the observation group and 45 healthy pregnant women were selected as the control group. Samples of placental tissue of two groups were collected. Apoptosisrelated gene caspase-3 expressions in placental tissue in two groups were detected by immunohistochemical method and vascular endothelial cells apoptosis of placenta were detected by TUNEL method. Results Vascular endothelial cells AI of placenta of the observation group and the control group were (0.89%±0.08%) and (0.28%±0.04%) respectively. Vascular endothelial cells AI of placenta of the observation group was significantly higher than that of the control group and the difference was statistically significant (t=7.59,P＜0.05). With the aggravation of disease, vascular endothelial cells AI of the mild preeclampsia group and severe preeclampsia group were (0.76%±0.06%) and (1.04%±0.02%) respectively which showed an increasing trend. The difference between two groups was statistically significant (t=6.29, P＜0.05). The positive expression rate of caspase-3 protein of vascular endothelial cells of placenta in the observation group was 62.2%, significantly higher than that in the control group 4.4% (x2=11.65,P＜0.01). Expressions of caspase-3 protein of vascular endothelial cells of placenta in mild preeclampsia group and severe preeclampsia group showed an increasing trend. The difference was statistically significant when two groups were compared (x2=9.91, P＜0.01). Conclusion Vascular endothelial cells apoptosis of placenta and overexpressions of caspase-3 play important roles in formation process of preeclampsia.

[Key words]Preeclampsia; Caspase-3; Vascular endothelial cells; Apoptosis