HPLC-ELSD法測定不同海拔高度桔梗皂苷的含量

陳良勝 方應權

HPLC-ELSD法測定不同海拔高度桔梗皂苷的含量

陳良勝 方應權

目的測定大別山不同海拔高度桔梗藥材的桔梗皂苷的含量, 為評價其質量品質提供理論依據。方法采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)法, KinetexC18色譜柱(4.6 mm×100 mm, 5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B), 梯度洗脫；流速0.4 ml/min。結果1000 m海拔高度以上地區桔梗藥材的皂苷含量差異性顯著, 700 m高度以下地區桔梗皂苷含量無顯著差異。結論桔梗皂苷的含量可能受陽光、氣溫等外在因子影響而發生變化, 為有效控制桔梗藥材的質量提供依據。

桔梗；海拔高度；高效液相色譜-蒸發光散射檢測器； 含量測定

桔梗(Radix Platycodi)為桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC.的干燥根, 在我國藥用歷史悠久, 具有宣肺、利咽、祛痰和排膿之效［1-3］。桔梗中主要成分是桔梗皂苷,現代藥理研究試驗表明：桔梗中的主要活性物質桔梗總皂苷具有廣泛的生物活性, 在免疫調節、抗炎、鎮痛、解熱、祛痰、保肝、降膽固醇、降血脂等方面的藥理活性引起了國內外的廣泛關注。桔梗在大別山均有種植, 氣候適宜, 病蟲害較少, 栽培技術成熟, 地形復雜且變化多樣, 各個海拔高度都有, 從丘陵到高山, 海拔高差大, 立體氣候明顯。本實驗采用HPLC-ELSD法, 桔梗對照品桔梗皂苷D, 測定不同海拔高度的桔梗皂苷含量, 探索海拔高度對桔梗藥材的質量的影響, 以期為桔梗藥材的質量評價提供可靠的科學依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 AGILENT 1100 LC 高效液相色譜儀(美國)；AGILENT CHEMSTAT ION 工作站(美國安捷倫科技公司)；檢測器：AGILENT DAD；色譜柱：Phenomenex-C18柱(250 mm×4.6 mm, 粒度5 μm；迪馬公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；梅特勒ME215S十萬分之一電子天平; 梅特勒CP224S萬分之一電子天平；超聲波清洗儀SD3200 (昆山市超聲儀器有限公司)；LK-COOA搖擺式高速中藥粉碎機。

1.1.2 試藥 桔梗皂苷D對照品(中國藥品生物制品檢定所, 批號為：111851-201204, 含量94.9%)；乙腈：色譜純；甲醇,甲酸∶分析純(川東化工集團有限公司化學試劑廠)；超純水 (自制)。桔梗藥材樣品采自大別山區雞公山不同海拔高度,見表1。共12批, 同一海拔地區橫向間隔100～150 m采一次樣, 將12批樣混合均勻, 粉粹干燥至恒重備用。并經重慶萬州食品藥品檢驗所方應權教授鑒定為桔梗科桔梗屬植物桔梗Platycodon grandiflorμm(Jacq.)A.DC.的根。

1.2 方法［4-6］

1.2.1 色譜條件 色譜柱：KinetexC18色譜柱(4.6 mm×100 mm, 5 μm)；流動相：流動相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B), 梯度洗脫。見表1。流速：0.4 ml/min；進樣量：20 μl。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定桔梗皂苷D對照品5.65 mg, 置于10 ml量瓶中, 加50%甲醇稀釋至刻度, 過0.45 μm微孔濾膜濾過即得, 進樣20 μl。見圖1。

圖1 桔梗皂苷D對照品色譜圖

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取桔梗藥材粉末(過二號篩)精密稱定2 g, 置錐形瓶中, 精密加入50 %甲醇25 ml, 超聲提取30 min, 放冷, 再稱定重量, 用50 %甲醇補足重量, 濾過,取續濾液, 過0.45 μm微孔濾膜濾過即得, 進樣20 μl。見圖2。

圖2 桔梗藥材樣品色譜圖

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 標準曲線的繪制 精密吸取桔梗皂苷D標準品溶液 40、80、160、200、2400 μl, 置 10 ml 具塞磨口試管中,于水浴蒸發至干, 精密加10%香草醛試液 0.5 ml, 60% 硫酸 5 ml 搖勻, 于水浴加熱 15 min, 冰水浴中冷卻 3 min, 以同法平行處理的空白溶劑為空白, 在472 nm處測定吸光度。以標準品濃度C (μl/ml) 為橫坐標, 吸光度A為縱坐標繪制標準曲線, 得到回歸方程為: A=0.0034 C+0.0064, r=0.9997, 結果看出C在此濃度系列范圍內與A呈現良好的線性關系。

1.2.3.2 精密度試驗 取同一批次桔梗樣品溶液, 按“2.1”項下條件連續進樣6次, 記錄指紋圖譜。計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的相對標準偏差(RSD)值, 結果顯示, RSD均<3%, 表明精密度良好。

1.2.3.3 重復性試驗 取同一批次桔梗樣品溶液共6份,按“2.1” 項下條件分別進樣20 μl, 記錄指紋圖譜。計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值, 結果顯示, RSD均<3%, 表明重復性良好。

1.2.3.4 穩定性試驗 取同一批次桔梗樣品溶液, 分別在0、2、4、6、8、12、24 h檢測, 記錄指紋圖譜。計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值, 結果顯示, RSD均<3%, 表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定性良好。

1.2.3.5 加樣回收率實驗 準確稱取已知含量的桔梗藥材已干燥粉末6份, 每份0.05 g, 加入桔梗皂苷 D 適量, 按照上述方法制備樣品溶液, 各取20 μl樣品液, 測定吸光度, 計算回收率。平均加樣回收率為96.97%, RSD為1.51%。

1.3 統計學方法 采用DAS2.0藥物代謝動力學軟件對數據進行回歸分析。

2 結果

依據方法“1.2”對不同海拔高度的12批次的桔梗皂苷含量測定。結果見表1。

表1 桔梗藥材藥品來源

3 小結

海拔高度對桔梗藥材成分影響較顯著, 700 m以下地區桔梗皂苷的含量無明顯差異, 較為接近, 700 m以上地區桔梗皂苷的含量出現明顯變化, 說明高海拔地區種植條件、產地對桔梗藥材產生影響。800 m以上地區陽光、氣溫等環境因素與低海拔丘陵山地地區出現較為大的變化。受到其他因素影響(氣候、土壤環境、采收時間等), 為保證桔梗藥材質量的穩定、可靠, 建議適宜的區域化種植。而桔梗皂苷含量與外在因子的相關性研究尚需進一步研究。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京: 中國醫藥科技出版社, 2010: 259-260.

［2］李文庭, 祝明, 馬臨科, 等.桔梗的HPLC-ELSD指紋圖譜研究.中國實驗方劑學雜志, 2011, 17(22): 50-53.

［3］李喜鳳, 杜云鋒, 謝新年, 等.不同采收期桔梗 HPLC指紋圖譜比較研究. 中成藥, 2010, 32(3) : 353.

［4］楊海玲, 張振凌, 李俊雅, 等.河南省不同產區桔梗飲片 HPLC指紋圖譜研究. 河南科技, 2010(5): 66.

［5］李喜鳳, 杜云鋒, 謝新年, 等.不同產地桔梗藥材HPLC 指紋圖譜及桔梗皂苷D含量測定研究. 中成藥, 2010, 32(4) : 529.

［6］宋健, 王穎, 石俊英.山東地產藥材桔梗的HPLC指紋圖譜研究.中國現代中藥, 2011, 13(9): 21-23.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.04.183

2014-10-21］

465550 河南省新縣人民醫院(陳良勝)；重慶三峽醫藥高等專科學校(方應權)

陳良勝