不同斑蝥素類物質(zhì)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖作用的研究

晏 容，劉 云，朱欣婷，易小飛，劉 流，李曉飛

（1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州遵義563003；3.貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義563003）

不同斑蝥素類物質(zhì)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖作用的研究

晏 容1，3，劉 云2，3，朱欣婷1，3，易小飛1，劉 流1，李曉飛1，3

（1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州遵義563003；3.貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義563003）

目的 觀察斑蝥素酸鎂、斑蝥素及斑蝥素酸鈉3種斑蝥素類物質(zhì)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的體外抗腫瘤活性。方法 （1）采用磺酰羅丹明染色法（SRB法）檢測(cè)不同濃度斑蝥素酸鎂、斑蝥素及斑蝥素酸鈉在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用；（2）使用透射電鏡觀察2.27 μmol/L斑蝥素酸鎂作用于肝癌細(xì)胞HepG248 h后細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 （1）斑蝥素酸鎂、斑蝥素及斑蝥素酸鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2有明顯抑制作用，抑制率隨藥物濃度的增加而升高，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為2.27、5.70、8.41 μmol/L；（2）透射電鏡下見(jiàn)核染色質(zhì)聚集成塊附著于核膜下，且見(jiàn)核異形等凋亡細(xì)胞形態(tài)特征。結(jié)論 斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用優(yōu)于斑蝥素和斑蝥素酸鈉，且斑蝥素酸鎂可以誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2發(fā)生凋亡。

斑蝥素/類似物和衍生物； 比色法； 肝腫瘤； 免疫組織化學(xué)； 染色與標(biāo)記； 細(xì)胞凋亡； 腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的

中藥昆蟲(chóng)芫菁體內(nèi)的斑蝥素被認(rèn)為是抗癌的主要有效物質(zhì)，其可治療原發(fā)性肝癌、喉癌、食管癌、宮頸癌等[1]。一直以來(lái)人們認(rèn)為斑蝥素在斑蝥體內(nèi)的存在形式只有一種游離態(tài)，但本研究發(fā)現(xiàn)，在斑蝥體內(nèi)存在游離斑蝥素和結(jié)合斑蝥素2種形式[2]，并且常用中藥斑蝥（大斑芫菁和眼斑芫菁）體內(nèi)的結(jié)合斑蝥素多數(shù)為斑蝥素的鹽類衍生物[3]，根據(jù)用藥的臨床經(jīng)驗(yàn)推測(cè)，這些鹽類衍生物具有更好的抗腫瘤作用。為了證實(shí)這一推測(cè)，本研究以提取眼斑芫菁體內(nèi)的斑蝥素為原料，自主合成了斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈉2種鹽類衍生物，并對(duì)其體外抗腫瘤活性進(jìn)行研究，以期獲取更好的具有較大價(jià)值的抗癌藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物來(lái)源 斑蝥素由產(chǎn)自貴陽(yáng)的眼斑芫菁提取并純化[4]（純度大于或等于98%）；斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈉由自制斑蝥素合成而來(lái)[5]。

1.1.2 肝癌細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司），南美胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)HYCLONE公司），磺酰羅丹明（SRB，美國(guó)Sigma公司）等。

1.1.4 主要儀器 3131型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；JEM-1400型透射電鏡（日本電子株式會(huì)社）等。

1.2 方法

1.2.1 人肝癌細(xì)胞HepG2的培養(yǎng) 采用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底部面積達(dá)80%左右，棄去培養(yǎng)液，給予磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 SRB染色法 將細(xì)胞懸液平行接種于4塊96孔板中（細(xì)胞濃度為8×104mL-1，每孔100 μL），其中1塊為對(duì)照板，另3塊為實(shí)驗(yàn)板，培養(yǎng)20 h后，采用50%三氯乙酸（TCA）固定對(duì)照板（T0），4℃保存待測(cè)。實(shí)驗(yàn)板中以加入不同濃度藥物（斑蝥素酸鎂、斑蝥素、斑蝥素酸鈉）組為實(shí)驗(yàn)組（T），同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（C）及溶劑對(duì)照組。每組有5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出培養(yǎng)板，依照參考文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行SRB染色。最后在酶標(biāo)儀上選擇530 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值（OD值），按照公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，腫瘤生長(zhǎng)抑制率

1.2.3 不同濃度斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2形態(tài)的影響 將不同濃度的斑蝥素酸鎂分別作用于人肝癌細(xì)胞HepG2，48 h后將其置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化。

1.2.4 透射電鏡觀察斑蝥素酸鎂作用后人肝癌細(xì)胞HepG2超微結(jié)構(gòu)的變化 于培養(yǎng)瓶中接種2×106mL-1的細(xì)胞懸液（每瓶4 mL），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。20 h后棄上清液，再加入配置好的斑蝥素酸鎂，藥物終濃度為半數(shù)抑制濃度（IC50），空白對(duì)照組加等量的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，依照參考文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行細(xì)胞樣品處理，最后上機(jī)觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用 1.25 μmol/L斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2有明顯的抑制作用，且隨著濃度的增加，其抑制作用更加明顯。以藥物濃度為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)作回歸曲線，得方程Y=74.703 ln（X）-11.571（R2=0.972 1）。最終計(jì)算得到IC50為2.27 μmol/L。見(jiàn)表1。

2.2 斑蝥素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用3.31 μmol/L斑蝥素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2有明顯的抑制作用，且隨著濃度的增加，其抑制作用更加明顯。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作回歸曲線，得方程Y= 71.560 ln（X）-74.595（R2=0.965 3）。最終計(jì)算得到IC50為5.70 μmol/L。見(jiàn)表2。

表1 斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響（n=5）

表2 斑蝥素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響（n=5）

2.3 斑蝥素酸鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用 5.25 μmol/L的斑蝥素酸鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用更加明顯。以藥物濃度為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)作回歸曲線，得方程Y=64.892 ln（X）-88.328（R2=0.987 0）。計(jì)算得到IC50為8.41 μmol/L。見(jiàn)表3。

表3 斑蝥素酸鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響（n=5）

2.4 不同濃度斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2形態(tài)的影響 與空白對(duì)照組比較，當(dāng)斑蝥素酸鎂濃度為1.25 μmol/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)目略減少；當(dāng)斑蝥素酸鎂濃度為1.88、2.50 μmol/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞貼壁差；當(dāng)斑蝥素酸鎂濃度為3.13、3.75 μmol/L時(shí)，僅剩余少數(shù)細(xì)胞，并且出現(xiàn)細(xì)胞皺縮，體積變小、變圓的現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2形態(tài)的影響（100×）

2.5 透射電鏡觀察斑蝥素酸鎂作用后人肝癌細(xì)胞HepG2超微結(jié)構(gòu)的變化 空白對(duì)照組肝癌細(xì)胞表面有突起，核質(zhì)比正常，核膜核仁清晰，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰可見(jiàn)（圖2A）。2.27 μmol/L斑蝥素酸鎂作用于肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞表面突起消失、核異形、核染色質(zhì)聚集成塊附著于核膜下（圖2B）。

圖2 斑蝥素酸鎂作用后人肝癌細(xì)胞HepG2超微結(jié)構(gòu)的變化

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用SRB法進(jìn)行體外抗肝癌活性篩選，該法已成為美國(guó)國(guó)立癌癥研究所篩選抗癌藥物的一種新方法[8]。SRB法是利用蛋白質(zhì)染色原理，避開(kāi)了某些腫瘤細(xì)胞還原酶活力低下，難以采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法這一難題，與MTT法比較，SRB法具有操作時(shí)間短、結(jié)果穩(wěn)定、可靠、靈敏等優(yōu)點(diǎn)[9]，現(xiàn)已成為新一代抗腫瘤藥敏試驗(yàn)及其他腫瘤藥理學(xué)研究的主要實(shí)驗(yàn)手段之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，斑蝥素酸鎂、斑蝥素、斑蝥素酸鈉對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2均有抑制作用，其中抑制作用最好的是斑蝥素酸鎂，其次是斑蝥素、斑蝥素酸鈉。斑蝥素是臨床常用藥物，具有較好的抗癌效果，但其不溶于水的化學(xué)性質(zhì)制約了其作為注射液的應(yīng)用，為此，已有研究制備出水溶性好的斑蝥素酸鈉用于臨床治療，并且已有斑蝥素酸鈉能有效抑制人肝癌細(xì)胞增殖的文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，斑蝥素酸鎂對(duì)肝癌細(xì)胞的體外抗癌活性好于斑蝥素和斑蝥素酸鈉，并且斑蝥素酸鎂具有一定的水溶性，可以開(kāi)發(fā)成針劑，解決了口服帶來(lái)的不良反應(yīng)大、藥物吸收少的問(wèn)題，具有很好的開(kāi)發(fā)潛能。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用透射電鏡觀察斑蝥素酸鎂作用于肝癌細(xì)胞HepG2后超微結(jié)構(gòu)的變化，鏡下見(jiàn)移植瘤細(xì)胞表面突起消失、核異形、核染色質(zhì)聚集成塊附著于核膜下等凋亡細(xì)胞形態(tài)變化，提示斑蝥素酸鎂可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2發(fā)生凋亡。下一步實(shí)驗(yàn)將選擇更多的人肝癌細(xì)胞，進(jìn)一步考察斑蝥素酸鎂對(duì)肝癌的抑制作用及其機(jī)制，為其研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of different cantharidin materials on proliferation of human hepatocellular carcinoma cells HepG2

Yan Rong1，3，LiuYun2，3，ZhuXinting1，3，YiXiaofei1，LiuLiu1，LiXiaofei1，3
（1.BasicMedicineSchool，ZunyiMedicalCollege，Zunyi，Guizhou563003，China；2.Medical and Biological Research Center，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；3.Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines，Zunyi，Guizhou 563003，China）

Objective To investigate the in vitro anti-tumor activity of three kinds of cantharidin materials magnesium cantharidate，cantharidin and sodium cantharidate on hepatocellular carcinoma cells HepG2.Methods （1）The sulforhodamine B（SRB）assay was employed to evaluate the inhibitory effect of magnesium cantharidate，cantharidin and sodium cantharidate on hepatocellular carcinoma cells HepG2 in vitro；（2）the transmission electron microscopy was used to observe the ultra-structural changes after 2.27 μmol/L magnesium cantharidate acting on hepatocellular carcinoma cells HepG2for 48 h.Results （1）Magnesium cantharidate，cantharidin and sodium cantharidate had obvious inhibitory effects on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells HepG2，the inhibitory rate was increased with the medication concentration increase，showing the dose-effect relationship，the half inhibitory concentrations（IC50）were 2.27，5.70，8.41 μmol/L，respectively；（2）the transmission electron microscopy found the morphological features of apoptotic cells，such as the nuclear chromatin was gathered into a block attaching to below the nuclear membrane，heteromorphic nucleus and so on.Conclusion The inhibiting effect of magnesium cantharidate on hepatocellular carcinoma cells HepG2is superior to that of cantharidin and sodium cantharidate，moreover magnesium cantharidate can induce the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells HepG2.

Cantharidin/analogs&derivatives； Colorimetry； Liver neoplasms； Immunohistochemistry； Staining and labeling； Apoptosis； Tumor cells，cultured

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.21.001

A

1009-5519（2015）21-3209-03

2015-07-20）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81560669）；貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合SY字[2012]3082）；貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合SY字[2011]3031）；貴州省教育廳特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目（黔教合KY字[2014]212）；遵義市匯川區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（E-114）。

晏容（1978-），女，貴州遵義人，碩士研究生，副教授，主要從事昆蟲(chóng)資源開(kāi)發(fā)與利用的研究；E-mail：yanr3725881994@sina.com。

李曉飛（E-mail：lixiaofei35@gmail.com）。