木蹄層孔菌乙醇提取物對小鼠肝臟和免疫細胞功能的影響

趙彥禹，張志敏，吳明松，王 哲，李學英

（遵義醫學院醫學遺傳學教研室，貴州遵義563099）

木蹄層孔菌乙醇提取物對小鼠肝臟和免疫細胞功能的影響

趙彥禹，張志敏，吳明松，王 哲，李學英

（遵義醫學院醫學遺傳學教研室，貴州遵義563099）

目的 研究木蹄層孔菌乙醇提取物對小鼠肝臟和免疫細胞功能的影響。方法 對小鼠口服灌胃低、中、高劑量（100、250、500 mg/kg）提取物，重復給藥試驗14 d，分別測定肝臟內丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）活力、脾臟淋巴細胞增殖能力、腹腔巨噬細胞吞噬能力和脾臟自然殺傷細胞（NK細胞）殺傷活性的變化。結果 不同藥物劑量組小鼠ALT和AST活力與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同藥物劑量組均能顯著刺激脾臟淋巴細胞增殖，對NK細胞的殺傷活性無顯著影響。高藥物劑量組[500 mg/（kg·d）]能顯著增加吞噬細胞的吞噬能力。結論 口服灌胃木蹄層孔菌乙醇提取物對實驗動物肝臟無明顯毒性，對其免疫系統無損害，并有促進個體淋巴細胞增殖的能力。

抗腫瘤藥（中藥）； 肝/損傷； 乙醇； 小鼠； 木蹄層孔菌； 免疫調節

藥用菌菇類用于治療疾病已有很長歷史，尤其是在中國、印度、日本和韓國[1-2]。在腸胃疾病、各種癌癥、支氣管哮喘和盜汗治療方面，這些傳統的中藥發揮著重要作用。但是，大部分中藥的使用方法均為民間流傳，對其帶來的不利于健康的影響注意不夠。世界衛生組織建議，在使用傳統草藥治療疾病時要同時注意其帶來的不良反應。

許多的多孔菌長期以來一直作為草藥應用于各種疾病[3]。例如，靈芝、硫黃菌、云芝、豬苓、樺褐孔菌和茯苓等。木蹄層孔菌是多孔菌的一種，已證明其具有醫學應用價值。在18～19世紀，木蹄層孔菌被用于止血敷料和包扎繃帶[4]。藥理學研究發現，這種草藥含有多種生物活性物質[5-9]。但就木蹄層孔菌提取物亞急性暴露后，對肝臟和免疫功能的影響的研究甚少。本實驗擬研究該提取物對小鼠肝臟和免疫細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 木蹄層孔菌乙醇提取物 將木蹄層孔菌子實體刷凈，沖洗，晾干，粉碎，用95%乙醇在45℃浸泡提取，同時，用超聲輔助提取，每次30 min。提取液濾紙過濾后真空濃縮，冷凍干燥獲得乙醇提取物。冷凍干燥后的提取物預先溶解于乙醇，用1%阿拉伯膠制備成混懸液，最終含乙醇量不超過1%。

1.1.2 實驗動物 實驗動物均為昆明小鼠，雌性，6～8周齡，體質量18～22 g，購于第四軍醫大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物處理 將48只小鼠隨機分成A、B、C、D組，每組12只。A組：空白對照組，口服灌胃雙蒸水；B組：口服灌胃木蹄層孔菌乙醇提取物，每天100 mg/kg；C組：口服灌胃該提取物，每天250mg/kg；D組：口服灌胃該提取物，每天500 mg/kg。藥物劑量的選擇參照以往研究[10]。

1.2.2 肝臟毒性評價 服用藥物2周后，所有小鼠空腹1夜，第2天摘取眼球取血。血樣室溫靜置后，3 000 r/min離心15 min，取血清，隨后進行肝臟內丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）活力測定，研究服用提取物后是否改變了2種酶的活力，從而影響了肝臟的正常功能。ALT和AST測定試劑盒購自南京建成生物公司。

1.2.3 小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力測定 服用藥物2周后，所有小鼠空腹1夜，第2天常規取小鼠脾臟[15]，制備空白對照組，低、中、高劑量藥物組的脾臟淋巴細胞懸液。將各組細胞懸液分別加入conA（終質量濃度5μg/mL），加樣96孔板，每孔100 μL，每組設5個重復（n=5），將細胞板放入37℃、5%CO2培養箱中培養48 h后取出，向每孔中加入20 μL噻唑藍（MTT）液，繼續培養4 h后取出，加入三聯液（10%SDS，5%異丁醇，0.01 mol/L Hcl）（每孔100 μL），酶標儀檢測吸光度值（OD值），作為淋巴細胞增殖的指標。測定波長為570nm，校正波長為630 nm，以溶液對照組的OD值為空白對照調零，實驗重復3次。

1.2.4 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力測定 取上述藥物處理小鼠的腹腔巨噬細胞，將細胞接種于 96孔板，貼壁后孵育24 h，棄上清液，加入0.75 g/L中性紅溶液每孔200 μL，置于37℃、5%CO2孵箱培養20 min后棄去上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗板 3次以上，除去細胞外中性紅。每孔加入細胞裂解液（1 mol/L醋酸與等體積無水乙醇的混合液）200 μL，置搖床上低速振蕩2～3h，待細胞完全溶解，以空白對照孔調零，在酶標儀上測波長為540 nm處的OD值。

1.2.5 小鼠脾臟自然殺傷細胞（NK細胞）殺傷活性測定 獲得小鼠脾細胞懸液后，以各實驗組小鼠脾細胞（1×107mL-1）為效應細胞，以經傳代培養的YAC-1細胞（5×105mL-1）為靶細胞，按20∶1的效靶比分別加入脾細胞和YAC-1細胞各50 μL于96孔培養板中，同時設效應細胞對照孔、靶細胞對照孔和空白對照孔。每個樣本做3個復孔。置于37℃、5%CO2孵箱中培養4 h，MTT法測細胞存活率。計算NK細胞殺傷活性[11]。

1.3 統計學處理 應用Origen8.0軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 肝臟毒理學評價 重復給藥實驗14 d后，對照組血清中ALT水平為（1.01±0.19）mmol/L，100、250、500 mg/kg劑量組小鼠血清ALT分別為 （1.35±0.27）、（0.87±0.14）、（0.92±0.23）mmol/L。不同藥物劑量組與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。重復給藥實驗14 d后小鼠血清ALT、AST活力見圖1。

2.2 不同劑量提取物對小鼠免疫細胞功能的影響 各藥物劑量均能顯著刺激脾臟淋巴細胞增殖；藥物劑量組對NK細胞的殺傷活性無顯著影響；500 mg/（kg·d）劑量組能顯著增加吞噬細胞的吞噬能力。見圖2。

圖1 重復給藥實驗14 d后小鼠血清ALT、AST活力

圖2 不同劑量提取物對小鼠免疫細胞功能的影響

3 討 論

因肝臟是防御毒物來襲的首道防線，大多數針對某種特定分子的毒理學分析均會評價其對肝臟功能和肝組織完整性的不利影響，各種有毒分子均會引起血清中ALT和AST活力的顯著增加，因此，對于某些物質而言，肝臟功能和肝組織完整性可作為毒性風險評估的可靠指標[12]。在本實驗中，與對照組比較，木蹄層孔菌乙醇提取物處理組小鼠血清中ALT和AST的活力無顯著性變化。各藥物濃度處理組小鼠ALT、AST水平與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。由此作者推斷，本實驗采用藥物劑量，口服灌胃木蹄層孔菌乙醇提取物對實驗動物無明顯毒性。然而，關于其持續使用對人類健康是否會造成潛在風險，本研究提供的數據不足以提供全面明確的依據。

免疫系統是動物機體的防御系統，一般由免疫器官、免疫細胞與免疫分子組成，可特異性或非特異性地排除侵入機體的異物。免疫細胞和免疫物質構成特異性免疫和非特異性免疫系統，其功能的增強或抑制均會影響機體免疫功能的發揮，甚至引發免疫性疾病。淋巴細胞增殖和分化是機體免疫應答過程中的一個重要階段，淋巴細胞增殖能力的強弱，在某種程度上代表了淋巴細胞功能的高低。本研究結果表明，不同劑量提取物均可加強正常小鼠淋巴細胞的增殖，從而加強免疫細胞的功能。

巨噬細胞是重要的免疫調節和效應細胞，通過吞噬殺傷微生物、抗原提呈和分泌細胞因子等作用進行免疫調控。本研究結果顯示，木蹄層孔菌乙醇提取物處理小鼠后，高藥物劑量組能增強巨噬細胞的吞噬能力，增強小鼠機體的非特異性免疫功能，低藥物劑量組未呈現同樣的功能，可能是由于藥物劑量太低，未起到相應的促進功能。

NK細胞是一類不表達特異性抗原識別受體的獨立淋巴細胞群，無需抗原預先致敏即可直接殺傷靶細胞，包括腫瘤細胞、病毒或某些胞內菌感染的細胞，是機體維持免疫監視功能的主要細胞。本研究結果還顯示，不同劑量木蹄層孔菌乙醇提取物對小鼠NK細胞的殺傷活性無顯著影響，與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），說明仍然維持在一個正常水平。

綜上所述，木蹄層孔菌乙醇提取物對受試小鼠未造成肝臟的損傷，對其淋巴細胞的增殖、吞噬細胞的吞噬能力起到增強作用，對NK細胞的活性無顯著影響。

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Effects of Fomes fomentarius ethanol extract on function of liver and immune cells in mice

Zhao Yanyu，Zhang Zhimin，Wu Mingsong，Wang Zhe，Li Xueying
（Teaching and Researching Section of Medical Genetics，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563099，China）

Objective To study the effect of Fomes fomentarius ethanol extract on the function of liver and immune cells in mice.Methods Mice were given oral gavage with the low，middle and high doses（100-500 mg/kg）of extract for conducting the 14 d repeated administration test.The activity changes of AST and ALT in liver，spleen lymphocytes proliferation ability，peritoneal macrophage phagocytosis ability and killing activity of spleen natural killer（NK）cells were measured.Results Serum AST and ALT detection results displayed that there was no statistical difference between the treatment group and the control group（P＞0.05）.The various drug concentration groups could significantly stimulate the proliferation of spleen lymphocytes，while had no obvious influence on the killing activity of NK cells.The high drug concentration group[500 mg/（kg·d）]could significantly increase the phagocytosis ability of peritoneal macrophage.Conclusion Oral gavage of Fomes fomentarius ethanol extract has no significant toxicity to the experimental animal liver，no damage to the immune system，moreover，has the ability promoting the proliferation of lymphocytes.

Antineoplastic drugs（TCD）； Liver/injuries； Ethano； Mice； Fomes fomentarius； Immune regulation

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.21.003

A

1009-5519（2015）21-3214-03

2015-09-09）

遵義醫學院博士啟動基金（F-702）。

趙彥禹（1975-），男，山東臨沂人，博士研究生，主要從事醫學遺傳學教學和分子遺傳學的研究；E-mail：xznuzhao@163.com。

李學英（E-mail：313627366@qq.com）。