水稻小G蛋白OsRab5b的亞細胞定位研究

邵軍麗 龍躍生 徐增富

（1.廣東醫學院公共衛生學院，東莞 523808；2.中山大學基因工程教育部重點實驗室 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣州 510275；3.廣州醫科大學附屬第二醫院神經科學研究所，廣州 510260；4.中國科學院西雙版納熱帶植物園熱帶植物資源可持續利用重點實驗室，昆明 650223）

小GTP結合蛋白（20-25 kD），簡稱小G蛋白，是一個很大的蛋白超家族，存在于所有的真核生物中，其功能依賴GTP的水解，是信號轉導的分子開關［1]。Rab蛋白是小G蛋白超家族中最大的一個家族，是3個（Ras、Rho和Rab）在羧基端存在翻譯后脂類修飾的小G蛋白家族之一，參與調節細胞內各個細胞器及內膜系統的運輸［1]。Rab蛋白的羧基端包含兩個半胱氨酸的高變區，翻譯后的脂類修飾發生在高變區末端的半胱氨酸上。這種脂類修飾是蛋白與膜結合必不可少的［2]，在酵母及動物中沒有發現例外。有意思的是，在植物中除了在羧基端進行脂類修飾的Rab5，即傳統的Rab5（植物中稱作Rab5a）外，還發現了植物特異的Rab5b類，如冰葉日中花（Mesembryanthemum crystallinum）的McRab5b（m-Rab（mc））［3]，擬南芥（Arabidopsis thaliana）的Ara6/AtRabF1［4]，輪藻（Chara australis）中的CaARA6（CaRABF1）［5]等。這類植物特異性的Rab5b羧基端缺少24-33個包括兩個半胱氨酸的高變區序列。取而代之的是N端比傳統的Rab5a多出13-26個保守的氨基酸序列。其中擬南芥的Ara6第二位甘氨酸在體外翻譯修飾實驗中可以豆蔻酰化，并在一定程度上影響Ara6細胞定位［6]。但其它植物中Rab5b第二位甘氨酸的作用還沒有研究。

水稻小G蛋白OsRab5b基因由林慧賢等［7]克隆和鑒定，它與冰葉日中花的McRab5b（GenBank AJ 006225）和百脈根的LiRab5b（GenBank Z73939）cDNA 核苷酸序列相似程度分別為74% 和76 %。在大腸桿菌中表達的GST-OsRab5b具有GTP結合活性［8]。本實驗研究OsRab5b在煙草BY-2細胞中的定位及OsRab5b第二位甘氨酸在其亞細胞定位中的作用，旨在為深入研究OsRab5b的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株和細胞 OsRab5b原核表達質粒、GFP植物表達質粒pYS22由本實驗室保存，OsRab5b-GFP與OsRab5b（Gly2Ala）-GFP（將第二位甘氨酸突變為丙氨酸）植物表達質粒為本實驗構建。農桿菌EHA105為本實驗室保存。煙草BY-2（Bright Yellow-2）細胞由香港中文大學姜里文教授惠贈。

1.1.2 試劑與培養基 乙酰丁香酮：少量DMSO（二甲基亞砜）溶解后，再用蒸餾水定容配成100 mmol/L母液；wortmannin：Sigma 19545-26-7；DMSO配成1 mmol/L貯存液；BFA：Sigma-Aldrich；B-6542；DMSO配成2.5 mg/mL貯存液；FM4-64：Molecular probe（T316），用氯仿配成12 mmol/L貯存液；固定液：50 mmol/L 磷酸鈉緩沖液 pH7.0，5 mmol/L EGTA，0.02% Azide，4.5%多聚甲醛；磷酸鈉-EGTA緩沖液：50 mmol/L磷酸鈉緩沖液pH7.0，5 mmol/L EGTA，0.02% Azide；封閉緩沖液 1（B1）：1×PBS，1%BSA；封閉緩沖液2（B2）：1×PBS，0.25% BSA，0.25%Gelatin，0.05% NP-40，0.02% Azide。VSRAt-1抗體由香港中文大學姜里文教授惠贈。農桿菌EHA105培養基為YEB。BY-2細胞培養基為植物組織培養常規培養基MS。

1.2 方法

1.2.1 OsRab5b蛋白序列分析 利用軟件Clustal X 1.83進行多重蛋白序列比對。進化樹分析采用軟件MEGA 4.0［9]（http：//www.megasoftware.net/）。選用N-J（Neighbor-Joining）法，bootstrap 值通過10 000次的重復確定。蛋白序列比對用到的Rab5同源蛋白基因的GenBank序列號依次是：OsRab5b（AF323991），LjRab5b（Z73939），McRab5b（AJ006225），Ara6（NM_115341），NtRab5（X63875），LjRab5a（Z73938），Rha1（X59152），OsRab5a（AY029301），HsRab5a（M28215），YeastYpt51（P36017）。

1.2.2 載體構建及農桿菌轉化 以OsRab5b原核表達質粒為模板，擴增野生型的OsRab5b讀碼框和突變型的OsRab5b（Gly2Ala）讀碼框，所用引物如下：

OsRab5b：上游引物（XhoI）5'-TAATTCATGGGTTGCT-3'，下游引物（KpnI）5'-TAAGACGCCGTTGGCCTG-3'。

OsRab5b（Gly2Ala）：上游引物（XhoI）：5'-TA-AATTCATGGCTTGCT-3'，下游引物（KpnI）：5'-TAAGACGCCGTTGGCCTG-3'。

PCR反應程序：94℃5 min；94℃30 s，53℃40 s，72℃50 s，共30個循環；72℃10 min。回收擴增產物。XhoI 和KpnI酶切擴增產物和GFP植物表達載體pYS22（含CaMV35S 啟動子），回收酶切后的擴增產物和線性載體。將酶切擴增產物與線性載體連接，得到OsRab5b-GFP與OsRab5b（Gly2Ala）-GFP質粒（圖1）。轉化大腸桿菌，提取質粒經測序、酶切鑒定。經鑒定成功的質粒用于轉化農桿菌，方法為電擊轉化法。電擊儀（Eppendorf公司生產的2510型）電擊參數為電壓1 800 V，持續5 ms。電擊結束后，加入YEB 液體培養基至電擊杯中，于28℃、100 r/min 培養4 h。取50 μL 菌液涂布含利福平（50 mg/L）和壯觀霉素（100 mg/L）的 YEB 固體平板上培養36 h。挑取菌落用YEB液體培養，提取質粒，酶切鑒定，鑒定成功的轉化菌株用于BY-2細胞的轉化。

圖1 OsRab5b-GFP與OsRab5b（Gly2Ala）-GFP質粒構建示意圖

1.2.3 BY-2細胞的轉化、wortmannin和BFA處理、免疫熒光標記、FM4-64的攝取實驗 均參照相關文獻［10，11]進行，簡述如下。

BY-2細胞的轉化：按1∶10繼代BY-2細胞，第3天，向培養皿加入4 mL BY-2懸浮細胞、4 mL MS培養基及乙酰丁香酮（終濃度50-100 μmol/L），反復吸打20次。加入100 μL OD=0.6左右的農桿菌，混勻，包上封口膜，28℃黑暗培養3 d后，將細胞轉入50 mL離心管。在50 mL 離心管中用40 mL MS液體培養基洗細胞，上下顛倒，自然沉降，棄上清，重復3-5次。1 mL MS液體培養基重懸BY-2細胞，涂于MS固體培養基（卡那霉素100 μg/mL，羧芐青霉素250 μg/mL），吸出所有液體。包上封口膜，28℃黑暗培養3-5周，即可見陽性克隆長出。

Wortmannin和BFA處理：取0.5 mL BY-2懸浮細胞于1.5 mL 離心管中，自然沉降，棄上清，加入新鮮MS液體培養基0.5 mL，根據實驗需要加入相應體積的wortmannin或BFA貯存液。避光放置1 h，取樣放于載玻片上，共聚焦掃描顯微鏡下觀察拍照。

BY-2細胞的免疫熒光標記：取1 mL 的細胞沉淀裝入15 mL 離心管中，加10 mL 固定液，混勻，常溫過夜。用磷酸鈉-EGTA洗細胞，室溫1 h 或4℃過夜。用磷酸鈉緩沖液配制的1%-3%細胞溶解纖維素酶（cellulysin cellulase）孵育細胞，室溫20-30 min。磷酸鈉-EGTA洗2次。加200-500 μL 0.5%Triton X-100孵育細胞，室溫2 min。B1洗細胞2次。B1封閉細胞，室溫30 min。離心棄去B1。加B2，按1∶50 或 1∶100 稀釋加入多克隆抗血清或4 μg/mL親和純化的一抗，4℃過夜。B2洗細胞3次，依次10、10和30 min。離心棄去B2，加新鮮B2，1∶100稀釋加入熒光標記的二抗，室溫放置 1 h。B2洗細胞3次，依次15、15和20 min。免疫熒光標記完畢，取樣放于載玻片上，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

BY-2細胞的FM4-64攝取：取0.5 mL BY-2懸浮細胞于1.5 mL離心管，自然沉降，棄上清，加入新鮮MS液體培養基500 μL，加入1 μL FM4-64（母液：12 mmol/L）混勻，冰上避光放置5 min。MS液體培養基洗2次（冰上）。洗完放于室溫，開始計時，15、30和60 min取樣放于載玻片上，共聚焦掃描顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 OsRab5b是一種植物特異性小GTP結合蛋白

圖2 OsRab5b和其它物種同源蛋白序列比對分析（A）及系統進化分析（B）

將OsRab5b與植物、人及酵母中的同源蛋白序列進行比對分析，結果（圖2-A）表明，Rab5b與Rab5a家族的成員有較高的相似性，兩類Rab5都具有在GTP結合蛋白家族中非常保守的5個結構域，即G1-G5。OsRab5b與其它植物特異性的Rab5b一樣，也缺少羧基端的一段不保守的含半胱氨酸的高變區序列，而氨基端多出一段氨基酸序列。采用程序WolfPSORT（http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp/）預測時，氨基端第二個甘氨酸會被豆蔻酰化。蛋白序列系統進化分析（圖2-B）也表明，植物中存在兩類Rab5，即Rab5a類和Rab5b類，OsRab5b屬于植物特異性的Rab5b。

2.2 Wortmannin和BFA對OsRab5b-GFP及其突變（Gly2Ala）蛋白分布的影響

為了研究OsRab5b在細胞中的定位及第二位甘氨酸在定位中的作用，分別構建了OsRab5b、OsRab5b（Gly2Ala）與報告基因GFP融合的植物表達質粒（圖1），并轉化到農桿菌EHA105。利用農桿菌介導法將2個GFP融合載體轉化到煙草BY-2細胞，通過共聚焦顯微鏡篩選得到GFP陽性克隆。OsRab5b-GFP轉基因細胞的GFP大部分呈點狀分布，少部分在細胞質彌散分布。OsRab5b（Gly2Ala）-GFP轉基因細胞的GFP全部彌散分布于細胞核和細胞質內（圖3）。Wortmannin 處理使OsRab5b-GFP 標記的細胞器膨脹成小的環狀結構；BFA 在100 μg/mL時使OsRab5b-GFP標記的細胞器聚集，但在 10 μg/mL時沒有引起OsRb5b-GFP標記的細胞器形態發生變化（圖3-A）。據此可以初步判斷OsRab5b-GFP 標記的細胞器是前液泡區（prevacuolar compartment）。Wortmannin和 BFA處理沒有引起OsRab5b（Gly2Ala）-GFP信號的任何變化（圖3-B）。

2.3 OsRab5b與前液泡區標記物VSRAt-1的共定位

為了進一步確證OsRab5b-GFP 定位于前液泡區，本研究選用擬南芥液泡分選受體VSRAt-1作為前液泡區標記物對OsRab5b-GFP轉基因細胞進行了免疫熒光標記。如圖4所示，在沒有藥物（圖4-A）及有藥物處理（圖4-B，4-C，4-D）時，OsRab5b-GFP標記的細胞結構都有一部分被VSRAt-1抗體染色。

2.4 OsRab5b與內吞示蹤染料FM4-64的共定位

圖3 OsRab5b-GFP（A）和OsRab5b（Gly2Ala）-GFP（B）轉基因細胞對藥物wortmannin和BFA的反應

OsRab5b定位于內吞途徑的前液泡區（晚期內吞體），所以OsRab5b應該和內吞示蹤染料FM4-64有共定位。為了驗證這個假設，本研究進行了轉基因BY-2細胞的FM4-64攝取實驗。如圖5所示，在轉基因細胞攝取FM4-64的60 min，而不是較早的15 min和30 min時，OsRab5b-GFP標記的結構大部分被FM4-64標記。

3 討論

Wortmannin 可以使前液泡區（晚期內吞體）膨脹形成小的空泡（small vacuoles），熒光圖上表現為小的環狀結構，但不會影響高爾基體［11，12]。BFA低濃度時（5-10 μg/mL）使高爾基體形成聚集，不影響前液泡區形態。但是，BFA 高濃度時（50-100 μg/mL）既可以使高爾基體也可以使前液泡區形成聚集［10]。根據本研究藥物處理的結果，可以推斷OsRab5b-GFP 定位于前液泡區。擬南芥液泡分選受體VSRAt-1主要定位于煙草BY-2細胞的前液泡區［11]，本研究將VSRAt-1作為前液泡區的標記物，對OsRab5b-GFP轉基因細胞進行了VSRAt-1抗體免疫熒光標記，結果表明OsRab5b有一部分和VSRAt-1共定位于前液泡區。FM4-64是一種苯乙烯基熒光染料，可通過內吞進入細胞，常被用作內吞示蹤染料［13，14]。OsRab5b-GFP轉基因細胞的FM4-64攝取實驗表明OsRab5b主要定位于晚期內吞體，即前液泡區［11，15]。綜合上述3個亞細胞定位實驗，可以判定OsRab5b定位于前液泡區。

圖4 OsRab5b-GFP和前液泡區標記物VSRAt-1的共定位

圖5 OsRab5b-GFP定位于FM4-64標記的內吞途徑上的晚期內吞體（即前液泡區）

在冰葉日中花中，McRab5b除了大部分定位于BP-80和AtPEP12p標記的前液泡區，還與JIM84和ST標記的高爾基體結構有一定程度的聯系［3]。同樣，輪藻CaARA6既有內吞體定位，也有高爾基體定位［5]。那么被OsRab5b-GFP標記而沒有被VSRAt-1標記的結構也有可能是高爾基體結構。前液泡區，也叫晚期內吞體，是內吞途徑的細胞器，而高爾基體是分泌途徑的細胞器。一種蛋白可以既定位于分泌途徑又定位于內吞途徑，并不矛盾。因為已經有很多證據表明內吞途徑和分泌途徑可以在高爾基體［16]、早期內吞體［15]和前液泡區（晚期內吞體）匯合［17]。這就提示，OsRab5b可能在內吞途徑和分泌途徑都發揮功能，這可作為下一步研究的方向。還有一部分OsRab5b-GFP信號彌散于細胞質中，這與Rab5在膜與細胞質兩個區域循環［18]一致。

OsRab5b（Gly2Ala）-GFP彌散分布于細胞核和細胞質內，而且wortmannin和BFA處理沒有引起OsRab5b（Gly2Ala）-GFP信號的任何變化，所以可以推測第二位甘氨酸具有引導OsRab5b正確定位的功能。

從轉基因細胞的激光共聚焦顯微鏡圖片上看，一個非常有趣的現象是OsRab5b（Gly2Ala）-GFP表達量遠高于OsRab5b-GFP，這在植物中還未見報道。這可能是因為OsRab5b（Gly2Ala）-GFP定位錯誤，功能喪失，導致降解調節機制失靈，最后造成了OsRab5b（Gly2Ala）蛋白的大量積累。在動物細胞中也存在類似的現象。Rab5、Rab7羧基端的異戊烯化被藥物洛伐他汀（lovastatin）抑制后，其蛋白量增加4倍之多［19]。因此，對這一現象的分子機制進行深入研究具有重要意義。

4 結論

水稻小G蛋白OsRab5b屬于植物特異性的Rab5b類。3個定位實驗都表明OsRab5b定位在BY-2細胞的前液泡區，即晚期內吞體，可能在內吞及分泌過程中發揮功能。突變體OsRab5b（Gly2Ala）彌散分布于細胞核和細胞質內，所以OsRab5b的第二位甘氨酸在該蛋白的正確定位中具有重要作用。

致謝：本研究得到了香港中文大學姜里文教授和繆嚴松博士的大力幫助，在此表示衷心的感謝。

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