聚酰胺-胺-Fe3 O4 復合納米粒子的制備及細胞毒性研究

付春華，董平軒，顧相伶，孫漢文，宋新峰，張彥聰

(1.德州學院 醫(yī)藥與護理學院，山東 德州 253023;2.山東省新型藥用輔料及緩控釋制劑工程實驗室，山東 德州 253023)

超順磁性四氧化三鐵納米粒子具有顯著的磁學性能、較低的生物毒性以及良好的生物相容性，這些特點使其在藥物磁靶向傳輸和釋放、核磁共振成像、腫瘤熱療、生物傳感器與生物探針及酶工程載體等生物醫(yī)學領域有廣闊的應用前景［1-3］。同時，生物體內(nèi)的巨噬細胞和網(wǎng)狀細胞很容易識別IONP，作為轉(zhuǎn)基因載體IONP 可顯著提高基因轉(zhuǎn)染效率［4-5］。但是通過物理、化學方法獲得的IONP 粒子在應用時存在以下不足:首先，裸磁性粒子在水中分散性差、易聚集沉降，需要表面修飾提高其穩(wěn)定性;其次，IONP 表面缺乏可利用活性基團［6-8］，不易在其表面引入生物活性分子。利用聚合物對IONP 進行包覆是解決上述問題最有效的途徑之一。利用高分子本身的特性賦予IONP 良好的生物相容性、分散性及特殊應用目的，我們課題組在前期對IONP 改性、生物學評價的基礎上［9-12］，用樹枝狀高分子PAMAM對IONP 進行接枝，并對不同基團封端的復合粒子的細胞毒性進行了初步評價。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、甲醇、甲苯、乙二胺(en)、丙烯酸甲酯(MA)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilan，APTS)均為分析純;細胞株HepG2，購自北京生化研究所;CCK-8 試劑盒，購自Yeasen 公司。

Zetasizer Nano ZS 馬爾文粒度儀;Spectrum GX紅外光譜儀;SEM-EDS 掃描電鏡-能譜儀;MERLIN Compact 掃描電鏡;布魯克X 射線能譜儀EDS;731型可見分光光度計。

1.2 IONP 的制備

將FeCl3·6H2O 和FeSO4·7H2O 按物質(zhì)的量之比2∶1 的比例溶解于去離子水，高速攪拌下加入一定量氨水，共沉淀獲得超順磁性、表面帶有羥基的IONP。

1.3 PAMAM-IONP 復合粒子的制備

參照文獻［12］的工藝路線，IONP 分散于甲苯溶液中超聲30 min 后加入APTS，120 ℃回流反應，得到表面氨基化的粒子NH2-IONP(G0)。利用G0表面的氨基與丙烯酸甲酯(MA)在低溫下進行邁克爾加成反應后磁分離，獲得G0.5 的IONP 粒子。G0.5粒子與過量乙二胺氨解后磁分離獲得G1. 0 代粒子。重復邁克爾加成和胺解反應，獲得所需代數(shù)的PAMAM-IONP 復合粒子。通過控制反應步驟，得到表面為酯鍵封端和氨基封端不同的粒子。

1.4 可見分光光度計測量復合粒子中聚合物的含量

實驗原理是Fe2+與鄰二氮菲在pH 為3 ～9 的條件下生成橘紅色絡合物，該橘紅色絡合物最大吸收波長為510 nm，可見分光光度計測量［13］。按一定濃度梯度稱量IONP 置于容量瓶中，加入鹽酸超聲波處理將粒子中的鐵元素轉(zhuǎn)化為Fe3+和Fe2+。然后加入過量鹽酸羥胺將Fe3+轉(zhuǎn)還原為Fe2+后調(diào)節(jié)pH 值，加入過量鄰二氮菲反應規(guī)定時間后，測量得到吸光度與Fe3O4濃度的標準曲線。用同樣方法處理接枝G5.0 代的復合粒子后測定吸光度，從而間接計算PAMAM 聚合物的質(zhì)量含量。

1.5 材料細胞毒性試驗——MTT 法

實驗用納米粒子經(jīng)低溫間歇滅菌法(60 ℃、10 h，37 ℃、12 h，連續(xù)3 次)，并用無菌水溶液多次洗滌后，按照不同濃度加入細胞培養(yǎng)基。取對數(shù)期的HepG2 細胞在IONP 種類和含量不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用CCK-8 試劑盒在免疫酶標儀(Multiskan MK3353，USA)上測定492 nm 處的吸光度(OD)值。計算細胞相對增殖率(relative growth rate，RGR)，從而判斷粒子的細胞毒性。

2 結果與討論

2.1 IONP 及PAMAM-IONP 復合粒子的特征

使用1.2 節(jié)所述共沉淀法制得的IONP 粒子，通過掃描電鏡觀察，結果見圖1。

圖1 IONP 的掃描電鏡圖Fig.1 SEM spectra of IONP

由圖1 可知，粒子大小分布均勻、表面相對圓整，直徑在10 ～20 nm 之間，符合后期應用對粒子尺寸的要求。少量粒子有團聚現(xiàn)象，使用前超聲波處理可得單分散的磁性粒子。

IONP 與PAMAM-IONP 的掃描電鏡-能譜(SEMEDS)檢測結果見圖2。

圖2 IONP(1)與PAMAM-IONP(4，G5.0)EDS 圖譜Fig.2 EDS spectra of IONP (1)and PAMAM-IONP(4，G5.0)

圖2 顯示，修飾前后，粒子中Fe、O、C 以及Si 等元素的含量有明顯變化。其中，F(xiàn)e 元素所占質(zhì)量百分比降低，而O、C 以及Si 等元素的質(zhì)量百分比增加。為更加清晰的了解這一變化趨勢，將各元素相應的含量計算并列于表1 中。表中數(shù)據(jù)進一步表明，隨著修飾代數(shù)的增加，C 元素的含量逐漸增加。該結果初步表明:PAMAM 成功的接枝IONP，獲得目標產(chǎn)物復合粒子。

此外，表1 中也給出了所得粒子的水相粒徑和電位結果。與SEM 觀察所得粒徑不同，馬爾文粒度儀測試IONP 粒徑結果為696.2 nm。究其原因，我們認為，由于裸IONP 粒子在水溶液中穩(wěn)定性差、易聚沉，因此采用激光散射測試粒徑出現(xiàn)了較大誤差。粒子接枝修飾后，由于在水溶液中穩(wěn)定性增強、分散性得以改善，馬爾文粒度儀測試亦較為真實的反映了其粒徑。從粒子電位的測試結果來看，使用PAMAM 對IONP 表面修飾后，其電位從－ 4. 28 mV 變化 為－23.30 mV，證明修飾后的粒子得以在水相穩(wěn)定性增強，進一步證明PAMAM 成功的接枝IONP。

表1 不同粒子的粒徑、電位及EDS 元素檢測結果Table 1 The test data of particle size，potential and element content

2.2 紅外檢測結果

使用紅外光譜儀對不同粒子進行測試，結果見圖3。

圖3 不同粒子的紅外圖譜Fig.3 FTIR spectra of different particles

由圖3 可知，與裸磁粒子的紅外譜圖相比，APTS 氨 基 化 的 IONP 和 PAMAM-IONP 在3 400 cm－1附近出現(xiàn)顯著的吸收，對應于N—H 特征吸收峰，2 800 ～2 900 cm－1處的吸收對應于C—H的特征吸收峰。上述結果進一步表明，使用1.3 節(jié)所述方法可成功制備PAMAM-IONP 復合粒子。

2.3 殼層聚合物質(zhì)量含量測試結果

為進一步了解IONP 表面包覆的PAMAM 含量，用分光光度法測試了不同粒子的吸光度。IONP 粒子濃度與吸光度A 的標準曲線見圖4。

標準曲線的相關系數(shù)達到了0.991，該曲線可用于粒子濃度的標定。相關測試結果表明，接枝5.0 代的PAMAM-IONP 外層聚合物的平均質(zhì)量含量為(13.6 ±0.3)%，實驗結果重現(xiàn)性較好，復合定量測定要求。

2.4 細胞毒性實驗結果

將裸IONP、氨基封端復合粒子(PAMAM-IONP，G5. 0)和 酯 鍵 封 端 的 粒 子(MA-PAMAM-IONP，G5.5)分別以5，10，50，100，200，500 μg/mL 濃度梯度的培養(yǎng)液與HepG2 細胞共培養(yǎng)結果見圖5。

圖4 Fe3O4粒子濃度與吸光度A 的標準曲線Fig.4 The standard curve of Fe3O4 concentration and absorption

圖5 不同類型、不同濃度的粒子對細胞增殖的影響Fig.5 Effect of different particles on HepG2 cell proliferation

由圖5 可知，同一種磁性粒子的濃度低于200 μg/mL時，濃度對細胞的增殖性影響沒有明顯差異，但是當粒子濃度高至500 μg/mL 時，對細胞增殖的抑制性明顯增加。比較3 種粒子對細胞培養(yǎng)結果可以發(fā)現(xiàn)，濃度相同時，裸SIONP 細胞增殖數(shù)最小，而氨基封端的復合粒子細胞增殖數(shù)最高，表明氨基端的粒子細胞毒性最小，細胞安全性最佳，上述結果與文獻［14］報道一致，實現(xiàn)了材料表面改性修飾的目的。

3 結論

目前IONP 的應用主要集中在生命科學領域，因此對其修飾改性材料的生物安全性評價是能否進行后期研究的關鍵環(huán)節(jié)，而細胞毒性評價是生物安全評價的重要組成部分。本研究結果表明，采用樹枝狀高分子PAMAM 修飾的IONP 不僅改善了粒子在水溶液中的分散性和穩(wěn)定性，其細胞毒性也有明顯下降，且細胞毒性與粒子表面的基團的種類有關。因此后期根據(jù)不同的用途設計合理的分子結構提供了依據(jù)。

［1］ Jeong U，Teng X W，Wang Y，et al. Magnetic nanoparticles:preparation，physical properties，and applications in biomedicine［J］.Advance Materials，2007，19:33-60.

［2］ Weinstein J S，Varallyay C G，Dosa E，et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles:diagnostic magnetic resonance imaging and potential therapeutic applications in neurooncology and central nervous system inflammatory pathologies［J］.Journal of Cerebral Blood Flow ＆ Metabolism，2010，30:15-35.

［3］ Nakai G，Matsuki M，Harada T，et al.Evaluation of axillary lymph nodes by diffusion-weighted MRI using ultrasmall superparamagnetic iron oxide in patients with breast cancer:Initial clinical experience［J］.Journal of Magnetic Resonance Imaging，2010，30:15-35.

［4］ Pankhurst Q A，Connolly J，Jones S K，et al.Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine［J］. Journal of Physics D:Applied Physics，2003，36:167-181.

［5］ Akbarzadeh A，Samiei M，Davaran S.Magnetic nanoparticles:preparation，physical properties，and applications in biomedicine［J］. Nanoscale Research Letters，2012，7:144-152.

［6］ Issa B，Obaidat I M，Albiss B A，et al.Magnetic nanoparticles:surface effects and properties related to biomedicine applications［J］. International Journal of Molecular Sciences，2013，14:21266-21305.

［7］ Kostiantyn Turcheniuk，Arkadii V Tarasevych，Valeriy P Kukhar，et al.Recent advances in surface chemistry strategies for the fabrication of functional iron oxide based magnetic nanoparticles ［J］. Nanoscale，2013，5:10729-10752.

［8］ Ruiz A，Morais P C，Azevedo R B，et al.Magnetic nanoparticles coated with dimercaptosuccinic acid:development，characterization，and application in biomedicine［J］. Journal Nanoparticals Research，2014，16:2589-2608.

［9］ Sun H W，Zhu X J，Zhang L Y，et al.PDEA-coated magnetic nanoparticles for gene delivery to Hep G2 cells［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2013，18:648-654.

［10］孫漢文，張連營，朱新軍，等.PEGMA 磁性納米凝膠的光化學原位合成、表征及載藥性能研究［J］.中國科學(B 輯:化學)，2008，11:999-1005.

［11］孟繁宗，孫漢文，張連營，等. 熒光磁性微球Fe3O4@PMAA-Dy 的制備和表征［J］. 材料導報，2009(6):133-136.

［12］Wang J Z，Zhao G H，Li Y F.Reversible immobilization of glucoamylase onto magnetic chitosan nanocarriers［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2013(97):681-692.

［13］Zhang C，Jiang M G，Huang W，et al. Determination of iron ions in cooling water by spectrophotometry［J］. Journal of Salt and Chemical Industry，2013(11):45-47.

［14］Rasala R M，Janorkarc A V，Hirta D E.Poly(lactic acid)modifications［J］. Progress in Polymer Science，2010(35):338-356.