超聲波輔助提取蠶沙中葉綠素的工藝參數研究

韓敏

(西安文理學院 化學與化學工程學院，陜西 西安 710065)

葉綠素是廣泛存在于綠色植物體中的一種重要的天然食用色素，它不但可以作為食品、化妝品的著色劑、脫臭劑等，還具有一定的保健功能，如可治療多種疾病［1-2］。在高等植物中含有葉綠素a(C55H72O5N4Mg)和葉綠素b(C55H70O6N4Mg)兩種Chl-a:Chl-b≈3∶1［3-4］。葉綠素是脂溶性色素，不溶于水，可溶于丙酮、乙醇和石油醚等有機溶劑，在顏色上，葉綠素a 呈藍綠色，葉綠素b 呈黃綠色，葉綠素a 和葉綠素b 的分子結構如圖1 所示。

根據目前的研究進展，葉綠素的提取方法主要有以下幾種:丙酮研磨法、抽濾法、有機溶劑浸泡法、微波輔助提取法。本文采用超聲波輔助提取法對葉綠素提取工藝參數進行研究，超聲波提取法具有提取效率高、提取時間短、提取溫度低、適應性廣、提取工藝運行成本低，綜合經濟效益顯著;操作簡單易行，設備維護、保養方便等特點［5］。它不僅能將葉片細胞組織破壁或變形，而且可做低溫處理降低葉綠素的降解。

圖1 葉綠素的結構式Fig.1 Structural formula of chlorophyll

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

蠶沙:陜西安康旬陽;95%乙醇，化學純。

7230G 型可見分光光度計;HH-2 數顯恒溫水浴鍋;DZF-6050 型真空干燥箱;SC-Ⅲ多頻聲化學發生器。

1.2 提取工藝

蠶沙中葉綠素的提取工藝如下:

1.3 實驗方法

1.3.1 葉綠素含量的測定 準確吸取0.5 mL 超聲后的上層清液，用95%乙醇溶液定容至50 mL，分別測定649，665 nm 處的吸光度。按如下公式計算葉綠素含量［6］:

葉綠素a 濃度Ca= 13.95A665－6.88A649，mg/L

葉綠素b 濃度Cb= 24.96A649－7.32A665，mg/L

葉綠素總濃度Ct= 18.08A649+6.63A665，mg/L

葉綠素含量=Ct×提取液體積×稀釋倍數/樣品質量，mg/g。

式中，A665表示其在665 nm 處的吸光度，A649表示其在649 nm 處的吸光度。

1.3.2 單因素實驗設計 分別以不同的超聲頻率、乙醇濃度、時間、料液比、提取次數為單因素，考察各因素對超聲提取的影響。

1.3.3 最佳組合實驗條件的確定 本實驗從經濟、

實用、安全的原則，在單因素實驗的基礎上，主要選取料液比、提取時間、乙醇濃度3 因素3 水平，進行正交實驗，以葉綠素含量進行分析比較，選擇最佳組合實驗條件。正交實驗因素與水平設計見表1。

表1 正交實驗因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

2 單因素實驗結果分析

2.1 超聲頻率對葉綠素提取的影響

表2 超聲頻率對葉綠素提取的影響Table 2 The influence of ultrasonic frequency for extracting chlorophyll

準確稱取干燥的蠶沙粉末1.00 g，用9 mL 95%的乙醇為提取劑，在頻率為14，25，35 kHz 下超聲40 min;吸取上層清液0.5 mL，用50 mL 容量瓶定容;然后再用紫外分光光度儀在波長649，665 nm 處測其吸光度，計算葉綠素含量，選擇合適的頻率。

由表2 可知，超聲頻率為25 kHz 時，葉綠素的提取率最大，因而超聲頻率選25 kHz。

2.2 乙醇濃度對葉綠素提取的影響

準確稱取干燥的蠶沙粉末1.00 g，分別用9 mL不同濃度的乙醇為提取劑，在25 kHz 下超聲40 min;吸取上層清液0.5 mL，用50 mL 容量瓶定容;然后再用紫外分光光度儀在波長649，665 nm 測其吸光度，計算葉綠素含量，選擇合適的乙醇濃度。

圖2 乙醇濃度對葉綠素提取的影響Fig.2 The influence of ethanol concentration of chlorophyll extract

由圖2 可知，乙醇濃度越大對提取越有利。綜合提取率與經濟效益考慮，選取95% 的乙醇為最佳。

2.3 料液比對葉綠素提取的影響

準確稱取干燥的蠶沙粉末1.00 g，分別用5，7，9，10，12 mL 的95%乙醇為提取劑，在25 kHz 下超聲40 min;吸取上層清液0.5 mL，用50 mL 容量瓶定容;然后再用紫外分光光度儀在波長649，665 nm測其吸光度，計算葉綠素含量，選擇合適的料液比。

圖3 料液比對葉綠素提取的影響Fig.3 The influence of material liquid ratio on chlorophyll extract

由圖3 可知，料液比越大提取率越高。在1∶10(g/mL)之前，料液比對提取率的影響明顯大于其之后，為了節約試劑考慮，料液比選擇1∶10(g/mL)。

2.4 時間對葉綠素提取的影響

準確稱取干燥的蠶沙粉末1.00 g，用95%的乙醇10 mL 為提取劑，在25 kHz 下分別超聲10，20，30，40，50，60 min;吸取上層清液0.5 mL，用50 mL容量瓶定容;然后再用紫外分光光度儀在波長649，665 nm 測其吸光度，計算葉綠素含量，選擇合適的超聲時間。

圖4 時間對葉綠素提取的影響Fig.4 The influence of time for extracting chlorophyll

由圖4 可知，提取率隨時間的增加而增大。但在40 min 之后，曲線趨于平緩，如果繼續延長時間，會增加能源消耗，所以40 min 是一個比較合適的操作條件。

2.5 提取次數的選擇

準確稱取干燥的蠶沙粉末1.00 g，分別用10 mL的95%乙醇為提取劑，在25 kHz 下超聲40 min;吸取上層清液0.5 mL，用50 mL 容量瓶定容;然后再用紫外分光光度儀在波長649，665 nm 測其吸光度，計算葉綠素含量;然后離心分離，取濾渣，重復之前操作，選擇合適的超聲次數。

圖5 提取次數對葉綠素提取的影響Fig.5 The influence of the number for extracting chlorophyll

由圖5 可知，物料中的葉綠素隨著提取次數的增大而減少，在提取3 次之后葉綠素含量保持不變且很低。因而綜合考慮，提取3 次就能基本將其中的葉綠素提取出來，且相對而言節約成本。

3 正交實驗結果

在單因素實驗基礎上，綜合考慮主要因素對葉綠素提取率的影響，進行L9(3)3正交實驗，結果見表3。

表3 正交實驗結果Table 3 The orthogonal experiment results

由表3 可知，最優組合為A3B3C3，即以1 ∶12(g/mL)為料液比，用100%的乙醇在25 kHz 下超聲50 min 為最優提取條件。但是為了節約成本考慮乙醇濃度選90%。且由各因素的極差關系R2＞R1＞R3可知，超聲時間是影響葉綠素提取的主要因素，其次是料液比，乙醇濃度對葉綠素提取的影響最小。

4 結論

將單因素實驗與正交實驗結果對從蠶沙中超聲提取葉綠素的工藝條件進行優化，根據實際生產情況，獲得最佳提取工藝為:用90%乙醇作提取劑，干燥的蠶沙葉與提取劑的用量比為1∶12(g/mL)，在25 kHz 下超聲50 min，提取次數為3 次。

［1］ 王順民，牛彬.萵筍葉葉綠素的提取工藝研究［J］. 安徽工程科技學院學報，2007，22(4):14-17.

［2］ 汪坤，洪海，金文英，等. 微波輔助提取蠶沙中葉綠素的工藝研究［J］. 食品科學，2009，30(6):76-79.

［3］ 史銀飛，嚴桂琴，李一平.蠶沙葉綠素的提取工藝研究［J］.畜牧與飼料科學，2009，30(4):72-74.

［4］ 李祥，種亞莉，曹江絨，等. 微波協同超聲輔助提取蠶沙葉綠素的工藝研究［J］. 日用化學工業，2013，43(4):285-289.

［5］ 房媛.葡萄糖醛酸內酯清潔生產［D］.咸陽:陜西科技大學，2013.

［6］ 李合生.植物生理生長實驗原理和技術［M］.北京:高等教育出版社，2009.