人E2F1蛋白的表達及與Sed lin蛋白共定位研究

汪燕燕，潘林鑫，王夢媛，劉曉穎，范禮斌

人E2F1蛋白的表達及與Sed lin蛋白共定位研究

汪燕燕，潘林鑫，王夢媛，劉曉穎，范禮斌

摘要目的研究人E2F1蛋白在真核細胞內的表達及其與Sedlin蛋白的共定位。方法構建pcDNA3．1-E2F1-FLAG真核表達質粒，然后瞬時轉染至HEK 293T細胞內，Western blot法檢測E2F1蛋白的表達；瞬時單轉E2F1-FLAG和共轉E2F1-FLAG＋Sedlin-綠色熒光蛋白（GFP）至非洲綠猴腎細胞（COS7）內，免疫熒光制片，熒光顯微鏡下觀察E2F1-FLAG在細胞內的定位及其和Sedlin的共定位。結果真核表達質粒pcDNA3．1-E2F1-FLAG構建成功，且在HEK 293T細胞中能夠成功表達，在COS7細胞中主要定位在細胞核，且與Sedlin共定位于細胞核。結論人E2F1在HEK 293T、COS7細胞中都能夠正常表達，且與Sedlin蛋白存在共定位現象，為進一步了解人E2F1的功能及其蛋白質相互作用提供了一定的細胞學基礎。

關鍵詞E2F1；轉染；基因表達；細胞定位

細胞周期相關轉錄因子E2F1，最早是在研究［1［2］。該研究通過構建下游帶FLAG標簽的真核表達質粒pcDNA3．1-E2F1-FLAG，過表達于HEK 293T和非洲綠猴腎細胞（COS7）細胞中，探討E2F1蛋白在真核細胞中的表達及其與Sedlin蛋白的共定位情況，現報道如下。

2015－05－18接收

1　材料與方法

1．1質粒、菌株和細胞

包含人E2F1的cDNA序列由廈門大學韓家淮院士友情惠贈；TG1和DH5a大腸桿菌菌株、pcDNA3．1（＋）表達載體、pCD綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）-Sedlin表達質粒、以及COS7、HEK 293T細胞株皆由安徽醫科大學生命科學院生物學實驗室保存。

1．2主要試劑與儀器

擴增引物由上海生工生物公司合成；DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自美國Axygen公司；限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、Lambda DNA／EcoRⅠ＋HindⅢMarker以及T4 DNA連接酶均購自美國Fermentas公司；蛋白預染Marker購自美國Bio-rad公司；特級胎牛血清購自美國Clark公司；DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司；Opti-MEM減血清培養基和脂質體2000轉染試劑均購自美國Invitrogen公司；FLAG M2單克隆抗體購自美國Sigma公司；Western blot及IP細胞裂解液和一抗、二抗稀釋液均購自上海碧云天研究所；HRP和四甲基異硫氰酸羅丹明標記的山羊抗小鼠lgG抗體均購自北京中杉金橋公司；ECL顯色試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1．3方法

1．3．1質粒構建［3］

設計、合成下游帶有FLAG標簽的E2F1引物，上游引物：5’-CGGGATCCCGCCACCATGGCCTTGGCCGGGGC-3’；下游引物：5’-GGAATTCCTCA CTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTC GA AATCCAGGGGGGTGA-3’（斜體為FLAG標簽），以含人E2F1全長cDNA序列的質粒為模板，PCR擴增出目的片段；瓊脂糖電泳，膠回收試劑盒回收PCR產物；限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ分別對E2F1的PCR產物和pcDNA3．1（＋）載體進行雙酶切；16℃條件下，用T4連接酶連接過夜；次日用TG1或DH5a對連接產物進行轉化，37℃倒置培養；待長出單克隆，挑取數個單克隆進行搖菌，堿裂解法抽提質粒；EcoRⅠ和BamHⅠ進行酶切鑒定，選擇1管鑒定正確的質粒送生工有限公司測序。

1．3．2細胞準備

在蛋白表達的實驗中，對HEK 293T細胞進行常規傳代，以適當的密度接種至直徑為60 mm的培養皿中，培養過夜后待轉染。在免疫熒光實驗中，對COS7細胞進行常規傳代，在傳代的同時，取1張無菌的蓋玻片放入直徑為35 mm的培養皿中，用適當濃度的多聚賴氨酸對蓋玻片進行包被，充分晾干后種入適當密度的細胞，培養過夜后待轉染。

1．3．3質粒轉染

在蛋白表達的實驗中，待接種的HEK 293T細胞生長至密度約90%時，根據脂質體2000轉染試劑盒操作說明對細胞進行轉染，轉入質粒的量約為5μg，轉染后在Opti-MEM無血清培養基中繼續培養約6 h，換含有5%胎牛血清的培養基繼續培養，約48 h后收集細胞；在免疫熒光實驗中，轉染前COS7細胞密度約為50%，轉染方法同蛋白表達實驗。

1．3．4Western blot法檢測［4］

轉染24～48 h后，胰酶消化細胞，離心后收集細胞，PBS清洗2次；適量細胞裂解液懸浮細胞，4℃混懸30～60 min后，超聲破碎3 s；14 000 r／min、4℃離心10min收集上清液，即蛋白樣品；取適量加入等量的SDS上樣緩沖液（2×），沸水浴5 min后置冰水中冷卻；取適量樣品上樣，SDS-PAGE電泳（100 V、2 h），恒壓濕轉（100 V、1 h）；5%的脫脂奶粉或BSA溶液封閉1～2 h；一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜或室溫孵育2 h，TBST溶液洗膜3次；HRP標記山羊抗小鼠IgG二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST溶液洗膜；暗室中進行顯影。

1．3．5免疫熒光實驗檢測［5］

轉染后24 h左右，輕輕取出細胞爬片，細胞面朝上放置；滴加PBS清洗2～3遍；甲醇溶液（－20℃冷藏）固定2 min，70%的乙醇溶液繼續固定5 min，棄去乙醇；PBS清洗3次，用脫脂奶粉溶液（1%，TBST配制）封閉0．5 h，棄去封閉液；適量的一抗溶液（1∶200）室溫孵育1．5～2 h，棄一抗；封閉液清洗3次后，用適量的四甲基異硫氰酸羅丹明標記的二抗溶液（1∶200）室溫避光孵育1 h，棄二抗；PBS清洗3～4次，適量的DAPI（150 mg／L）溶液染色，室溫2～3 min，棄DAPI溶液；PBS溶液清洗3次，用濾紙盡量吸去細胞爬片上殘留的液體，用封片膠將爬片的細胞面輕輕封于干凈的載玻片上；待爬片固定后在熒光顯微鏡下進行觀察和拍攝。

2　結果

2.1pcDNA3.1-E2F1-FLAG質粒的酶切鑒定

對重組質粒pcDNA3．1-E2F1-FLAG進行BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，酶切鑒定的結果見圖1，第2泳道的重組質粒pcDNA3．1-E2F1-FLAG酶切后得到2條亮帶，通過與pcDNA3．1空載體酶切產物、E2F1 PCR產物以及Marker的橫向對比表明，一條亮帶是載體pcDNA3．1（5 400 bp），另一條亮帶是目的片段E2F1 （1 314 bp），表明該質粒成功連接。后續的測序結果也表明連接正確。

2.2E2F1蛋白在HEK 293T細胞中的表達

過表達E2F1的HEK 293T細胞裂解液，Western blot法分析后結果見圖2，轉染了pcDNA3．1-E2F1-FLAG 的HEK 293T細胞裂解液能夠檢測到條帶，通過與預染蛋白Marker的橫向比較，顯示條帶大小約為60 ku，與E2F1蛋白的分子量基本一致，且未轉染質粒的HEK 293T細胞裂解液未檢測到任何條帶，表明E2F1蛋白能夠在HEK 293T細胞中成功表達。

2.3E2F1蛋白在COS7細胞中的定位

利用熒光顯微鏡觀察E2F1-FLAG在COS7細胞中的定位，E2F1蛋白主要定位在細胞核內。見圖3。

2.4E2F1蛋白與Sed lin蛋白在COS7細胞中的共定位

利用熒光顯微鏡觀察E2F1-FLAG與Sedlin-GFP在COS7細胞中的共定位，E2F1蛋白與Sedlin蛋白存在共定位現象，主要共定位在細胞核內。見圖4。

3　討論

本研究通過質粒構建、Western blot法、免疫熒光等技術研究了E2F1在真核細胞內的表達和定位以及和Sedlin蛋白的共定位情況，結果表明，E2F1 在HEK 293T細胞內能夠成功表達，且在COS7細胞中的分布主要集中在細胞核，并與Sedlin蛋白共定位于細胞核，這將為繼續研究E2F1和Sedlin之間的相互作用的精細機制提供基礎。蛋白表達實驗之所以選擇HEK 293T是由于該細胞有較快的生長速度，而且轉染效率很高，蛋白表達量多，是瞬時轉染獲得胞內外蛋白常用的細胞株。熒光定位的實驗之所以選擇COS7細胞是由于該細胞有較強的貼壁能力，適合后期的免疫制片，而且其形態較大，鋪展較開，適合觀察蛋白的定位情況。

E2F家族目前有8個成員，命名依次為E2F1～8，家族成員之間存在著高度同源性，大部分成員都包含以下幾個保守區域：DNA結合區域、轉錄活化結合區域、DP二聚體結合區域。不同的E2F成員有特異性的結合區，根據啟動子的轉錄調節特性可以將E2F家族蛋白分為兩類：E2F1、E2F2和E2F3a稱為轉錄激活因子，受pRb的調節，促進細胞由G1 往S期的轉換［6］。E2F3b、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7 和E2F8稱為轉錄抑制因子，主要抑制細胞周期的轉化。在E2F家族中，活性最有特點的就是E2F1。E2F1是細胞周期重要的調控因子，當細胞周期處于G0／G1早期時，E2F1與DP、RB1結合形成一個復合物，其中E2F1的轉錄活性被未磷酸化的pRb所抑制［7］，同時也抑制了E2F1下游靶基因的表達。當細胞周期至G1晚期時，隨著Cyclin D／CDK4／6、Cyclin E／CDK2復合物的表達，引起pRb的高度磷酸化，導致大量E2F1被釋放，進而轉錄激活下游靶基因，促進細胞進入S期。當細胞周期處于S期時，E2F1在Cyclin A／CDK2復合物的催化下磷酸化失活，導致細胞進入G2／M期［8］。當細胞進入到新的細胞周期時，pRb將去磷酸化，與E2F1再次結合。E2F1的轉錄調節功能除了與RB1／E2F1信號通路有關外，還與依賴p53負反饋環［9］、miR-17／miR-20a miRNAs信號通路［10］的調控密切相關。除了對細胞周期的調控，E2F1還參與了細胞凋亡的誘導。另外，E2F1與腫瘤的發生發展有著密切的關系，在許多癌癥中都存在E2F1高表達的現象，如子宮內膜癌［11］、乳腺癌［12］等，但在某些癌癥中E2F1的表達量卻有所降低，如肝癌［13］，由此可見，E2F1存在癌基因和抑癌基因的雙重特性，因此，對其進行深入研究意義重大。在接下來的研究中，將用蛋白下拉技術、免疫共沉淀等技術，對E2F1和Sedlin的相互作用做進一步研究。

參考文獻

［1］Kovesdi I，Reichel R，Nevins J R．Identification of a cellular transcription factor involved in E1A trans-activation［J］．Cell，1986，45（2）：219－28．

［2］ChoiM Y，Chan CC，Chan D，et al．Biochemical consequences of sed lin mutations that cause spondyloepiphyseal dysplasia tarda ［J］．Biochem J，2009，423（2）：233－42．

［3］潘林鑫，李新穎，徐南，等．人RB1及其突變體的表達與定位［J］．安徽醫科大學學報，2013，48（8）：853－8．

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［13］王長青，吳江，周娟．E2F-1基因對HepG2肝癌細胞增殖影響的研究［J］．醫學綜述，2013，19（4）：722－4．

中圖分類號R 341；R 394．2

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1377－04

基金項目：國家自然科學基金青年基金（編號：81201368）；安徽省級大學生創新創業訓練計劃項目（編號：AH201410366017，AH201410366132）

作者單位：安徽醫科大學生命科學院生物學教研室，合肥230032

作者簡介：汪燕燕，女，碩士研究生；劉曉穎，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：liuxiaoying＠ahmu．edu．cn；范禮斌，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：lfan＠ahmu．edu．cn

The expression of human E2F1 and the co-localization with Sed lin

Wang Yanyan，Pan Linxin，Wang Mengyuan，etal
（Dept of Biology，College of Life Sciences，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo investigate the expression and localization of E2F1 in eukaryotic cells and the co-localization with Sedlin．MethodsTo construct eukaryotic expression plasmid pcDNA3．1-E2F1-FLAG．The plsamid was transfected into HEK 293T cells and the expression was checked by Western blot．Its expression in COS7 cells was detected by fluorescencemicroscopy．Resu ltsThe eukaryotic expression plasmid of pcDNA3．1-E2F1-FLAG was constructed successfully，which could be effectively expressed in HEK 293T and COS7 cells．E2F1 was predominantly distributed in the nucleus，and it co-localized in the nucleus with Sedlin．ConclusionE2F1 can overexpress efficiently in HEK 293T and COS7 cells，and it can colocalize with Seldin，which provides important bases for further study on E2F1 including its functions and associated proteins．

Key wordsE2F1；transfection；gene expression；cellular localization