m iR-210促進人牙周膜干細胞血管向分化作用的初步研究

古　月，王銀龍

m iR-210促進人牙周膜干細胞血管向分化作用的初步研究

古月，王銀龍

摘要目的構建miR-210的慢病毒載體（Lenti-miR-210-Luciferase），轉染人牙周膜干細胞（hPDLSCs）后，檢測成血管因子低氧誘導因子-1α（HIF-1α）及血管內皮生長因子（VEGF）在hPDLSCs的表達。方法分離培養hPDLSCs，并根據人miR-210基因（NC＿000011．9）序列行引物設計及序列片段的PCR擴增，將目的基因PCR產物連接到載體pLVX-EGFP-3FLAG-EF1-Luc上。將目的基因PCR產物和目的載體用EcoRⅠ和XbaⅠ分別進行酶切，對質粒進行鑒定。采用LR重組系統構建慢病毒載體Lenti-miR-210-Luciferase（Lenti-LacZ-Luciferase為對照組）。轉染hPDLSCs后，通過qPCR和免疫組化法檢測HIF-1α及VEGF的表達。結果通過對構建質粒克隆進行測序及酶切，證實Lenti-miR-210-Luciferase構建成功。Lenti-miR-210-Luciferase轉染hPDLSCs，0、1、4、7、14 d后行qPCR檢測，結果表明第4天HIF-1α和VEGF明顯過表達，且持續到第14天。免疫組化結果顯示，miR-210轉染hPDLSCs后，抗HIF-1α和抗VEGF染色呈陽性，對照組呈陰性。結論成功構建了慢病毒載體Lenti-miR-210-Luciferase，并且miR-210具有促進hPDLSCs血管向分化的作用。

關鍵詞牙周膜干細胞；miR-210；低氧誘導因子-1α；血管內皮生長因子；慢病毒載體

microRNAs（miRNAs）是一種內源性非編碼的單鏈小分子RNA，長度為20～22個核苷酸，到目前為止，人類基因組中有超過1 400個miRNA序列（1 424 miRbase：17．0）［1］。參與血管生成的內皮miRNAs，也被稱為angiomiRs［2］，其中miR-210在細胞低氧時高表達，在組織缺血時，miR-210對調控內皮細胞血管化具有決定性的作用［3］。牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是牙周組織中的成體干細胞，具有高度增殖、自我更新能力和多分化潛能［4－5］。臨床上人牙周膜干細胞（human PDLSCs，hPDLSCs）易于獲得，且不會引起額外的創傷。隨著組織工程技術的發展，把hPDLSCs作為轉基因靶細胞修復受損組織或器官具有重要的臨床應用價值。該研究用慢病毒（Lenti-miR-210-Luciferase）轉染hPDLSCs后，檢測低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，旨在證明miR-210可以促進hPDLSCs血管向分化作用，為miR-210介導的hPDLSCs進行體內實驗研究奠定基礎。

1　材料與方法

1．1材料DMEM培養基、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；10%胎牛血清（美國HyClone公司）；Realtime PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；一抗、二抗（英國Abcam公司）；NEAA、HEPES、pDONR221、高保真DNA聚合酶（platimumpfx DNA Polymerase）、pLenti6．3／V5-DEST、載體構建試劑盒（BLOCK-iTTM PolⅡmiRRNAi ExpressionVector Kitwith EmGFP）、表達載體pcDNATM6．2-GW／EmGFPmiR、病毒包裝細胞系293T、Packaging Mix及限制性內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ（英國Invitrogen公司）。

1．2實驗方法

1．2．1hPDLSCs的分離和鑒定

選擇11～18歲因正畸需要減數拔除前磨牙的患者，收集前獲得患者及其監護人的知情同意。臨床取材后，在超凈工作臺內，將牙齒牙冠向下用滴管吸取無血清DMEM培養液沖洗牙齒約30 s，以沖去牙齒上可能粘附的血液、異物或細菌等。然后將牙冠部分浸入75%酒精內消毒約2 min，再用無血清DMEM培養液沖洗牙齒約30 s。無菌條件下用銳利手術刀片刮取牙根中部1／3的牙周膜組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎塊，以5 mm間隔均勻鋪于6 cm培養皿底，加入1 ml含20%FBS、100 U／ml青霉素和100 U／ml鏈霉素的DMEM培養液，倒置于孵箱內，3 h后待組織塊貼壁完全，翻轉培養皿，加入3 m l上述DMEM培養液，繼續培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長及排列情況。從第4天開始，每3～5 d換液1次，7～15 d左右當細胞從組織塊周圍游出并

2015－05－08接收

1．2．2hsa-miR-210過表達載體構建

載體pLVXEGFP-3FLAG-EF1-Luc GENEBANK中人miR-210基因（NC＿000011．9）位于11p15．5染色體上。根據人miR-210基因序列信息設計引物及序列片段的PCR擴增。引物信息如下：hsa-miR-210-EcoR I：FCTCAAGCTTCGAATTCGGCTCGGACGCCCAAGTT；hsa-miR-210-Xba I：RCGCAGATCCTTCTAGACAGCCTCAGCCCCACCAA。下劃線處分別為EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點。

將目的基因PCR擴增產物和目的載體pLVXEGFP-3FLAG-EF1-Luc用EcoRⅠ和XbaⅠ分別進行酶切。電泳分離酶切片段，切膠回收目的片段。目的基因與載體片段同源重組后轉化E．coli感受態細胞。用菌落PCR鑒定轉化子，陽性克隆送測序，測序無誤的克隆進行質粒抽提。

1．2．3構建慢病毒載體

利用pLVX-EGFP-3FLAG-EF1-Luc作為載體，采用螢火蟲的熒光素酶（Luciferase）作為報告基因，為本實驗提供特異、穩定、高效的表達標記，使用Invitrogen公司的慢病毒系統（Lentivirus）包裝，將慢病毒載體Lenti-miR-210-Luciferase和 Lenti-LacZ-Luciferase分別轉染293T細胞，收集病毒液后進行濃縮。

1．2．4慢病毒液滴度測定

將收集到的慢病毒液冰水浴融化后，用含有polybrene 8μg／m l和2% FBS的細胞培養液進行10倍比滴度稀釋后感染HEK293細胞，觀察各稀釋孔病毒感染情況并計數，根據可數的最小梯度稀釋孔的熒光細胞數目計算慢病毒滴度。經檢測本實驗制備的病毒滴度為1× 108，完全滿足本實驗的需要。

1．2．5熱成像檢測實驗

hPDLSCs培養至第3代，根據慢病毒的滴度（1×108），按照每孔2×105個細胞接種于6孔板中，待細胞生長至70%～80%融合時，加入相應體積的慢病毒轉染hPDLSCs，目的基因轉染hPDLSCs后，進行熱成像檢測試驗。

1．2．6體外檢測miR-210促進hPDLSCs成血管作用

1．2．6．1qPCR檢測成血管因子HIF-1α及VEGF的表達

在培養皿中分別放入Lenti-miR-210-Luciferase／hPDLSCs、Lenti-LacZ-Luciferase／hPDLSCs及hPDLSCs培養，后兩者為對照組。然后在轉染后0、1、4、7、14 d提取總RNA行qPCR檢測HIF-1α和 VEGF表達。

1．2．6．2細胞免疫組化及細胞核染色檢測HIF-1α及VEGF蛋白的表達

將轉染成功后的細胞接種于培養皿中，5 d后進行免疫組化染色，4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗去固定液；乙醇溶液梯度水化；3%過氧化物消除內源性過氧化物酶；EDTA修復；在1%BSA封閉液中室溫封閉30 min～1 h；加入即用型一抗（鼠抗人HIF-1α單抗，鼠抗人VEGF單抗），4℃冰箱過夜；PBS清洗，加入二抗，溫育0．5 h，沖洗后DAB顯色，蘇木精對比染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結果。

1．3統計學處理

2　結果

2.1原代培養hPDLSCs的觀察

原代培養hPDLSCs 5 d左右，組織塊周圍有細胞爬出。細胞大部分呈梭形，似成纖維樣細胞（圖1）。

2.2Lenti-m iR-210-Luciferase和Lenti-LacZ-Luciferase慢病毒載體構建

利用pLVX-EGFP-3FLAG-EF1-Luc作為載體，目的基因同源重組入表達載體的陽性克隆鑒定（圖2）。

2.3目的基因轉染hPDLSCs后熱成像檢測

實驗結果表明Lenti-miR-210-Luciferase轉染hPDLSCs（圖3A）后，熱成像檢測結果表明Luciferase高表達（圖3B）。

2.4qPCR檢測m iR-210促進hPDLSCs血管向分化作用

采用慢病毒載體，用miR-210轉染hPDLSCs，在轉染后0、1、4、7、14 d提取總RNA行qPCR檢測關鍵成血管因子HIF-1α和VEGF表達。在轉染后的第4天，HIF-1α和VEGF明顯過表達，HIF-1α在第7天達峰值，第14天時仍維持在較高水平；VEGF直到第14天仍有上升趨勢。hPDLSCs和Lenti-LacZ-Luciferase組也有HIF-1α和VEGF的表達，與Lenti-miR-210-Luciferase組比較差異有統計學意義（P＜0．01）。見圖4。

2．5免疫細胞化學染色

miR-210轉染hPDLSCs后進行染色，結果顯示，抗HIF-1α和抗VEGF染色呈陽性（細胞核有棕色反應），對照組呈陰性（細胞核為藍色）。見圖5。

3　討論

節段性骨缺損（segmental bone defect，SBD）的修復是目前臨床醫學亟待解決的難題之一。隨著材料學、分子生物學及基因治療學的發展，運用基因增強的組織工程技術修復骨缺損成為當前的研究熱點［6－8］。但在修復SBD時，組織工程骨的血管化問題是制約其最終治療效果的關鍵因素。構建有效的血管化組織工程骨是當下必須要解決的一個課題，目前的研究重點主要集中在以下幾個方面：①血管化支架材料的構建；②血管生長因子的應用；③血管細胞和干細胞的血管化；④顯微外科技術修復血管［9］。在運用基因增強的組織工程技術修復骨缺損的研究中，基因調控種子細胞的成血管作用日益受到關注，并在一系列動物實驗中得到滿意的效果，如骨形成蛋白-2、核心結合因子1、堿性成纖維細胞生長因子、VEGF等［10－11］。

miR-210是一種由低氧誘導表達的miRNA，已證實miRNA-210在低氧導致的血管新生過程中表達量明顯上升，因此被稱為低氧特異性miRNA（hypoxamir），其表達比較穩定［12］。采用慢病毒載體可以使miR-210在體內穩定表達，而且在病毒載體上連接Luciferase可以體內示蹤目的基因在體內表達。所以本實驗構建了Lenti-miR-210-Luciferase的慢病毒載體，qPCR結果顯示轉染目的基因的hPDLSCs過表達HIF-1α和VEGF，Lenti-miR-210-Luciferase組的表達明顯高于hPDLSCs和Lenti-LacZLuciferase組，hPDLSCs和 Lenti-LacZ-Luciferase組也有少量表達，這可能是由于hPDLSCs本身具有內源性的HIF-1α和VEGF基因。hPDLSCs轉染miR-210基因后，HIF-1α和VEGF的mRNA表達明顯增加。與Lenti-miR-210-Luciferase組比較，hPDLSCs和Lenti-LacZ-Luciferase組HIF-1α和VEGF的表達都維持在較低的水平，說明使用慢病毒載體后并沒有影響HIF-1α和VEGF基因mRNA的合成。miR-210轉染hPDLSCs后進行免疫組化染色，結果顯示，抗HIF-1α和抗VEGF染色呈陽性，對照組染色呈陰性。與對照組比較，轉染miR-210的hPDLSCs表達HIF-1α和VEGF。雖然qPCR結果顯示Lenti-LacZ-Luciferase組可少量表達HIF-1α和VEGF，但免疫組化染色未能檢測出這兩種因子，可能是因為Lenti-LacZ-Luciferase組表達的量過少以致染色無法顯示。本實驗結果揭示了miR-210具有促進hPDLSCs血管向分化的作用。然而，由于本實驗只是miR-210具有促進hPDLSCs血管向分化作用的體外實驗部分，在未來的研究中可以構建動物模型研究miR-210介導的血管化組織工程骨在修復骨缺損中的作用，以期為臨床上有效解決SBD的生物功能重建提供可靠的實驗依據。

血運重建被認為是骨組織工程繼種子細胞、支架材料、細胞因子三大要素之后的第四大要素，如何解決組織工程骨的血管化問題是目前需要解決的一個關鍵問題。miR-210是血管形成的調控因子，能否采用組織工程技術，以hPDLSCs為靶細胞，利用miR-210構建血管化組織工程骨有待進一步研究。本實驗旨在為將來應用miR-210介導的hPDLSCs重建血管和修復骨缺損的體內外研究奠定基礎。

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中圖分類號Q 782；Q 342

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1381－05

基金項目：安徽省科技廳重點課題（編號：10021303003）

作者單位：安徽醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科，合肥230032

作者簡介：古月，女，碩士研究生；王銀龍，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：wangylah＠sina．com達70%～80%融合時，0．25%胰酶消化傳代，首次傳代比例為1∶1。所用的細胞需要經過2代擴增。第3代細胞接種24 h后進行基因轉染。

The prelim inary research ofm iR-210 promoting human periodontal ligament stem cells the differentiation of angiogenesis

Gu Yue，Wang Yinlong
（Dept of Oral and Maxillofacial Surger，The Affiliated Stomatology Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo construct the lentiviralvector Lenti-miR-210-Luciferase，and to detectangiogenic factorsHIF-1αand VEGF expression in hPDLSCs transduced by Lenti-miR-210-Luciferase．MethodshPDLSCswere isolated and cultured，and according to humanmiR-210 gene sequence（NC＿000011．9），its primerwas designed and amplified through PCR．The PCR products of the target gene were connected to the vector pLVX-EGFP-3FLAGEF1-Luc．To identify the plasmid，target gene PCR product and the purpose vectorwere digested by EcoRⅠand XbaⅠ．Lenti-miR-210-Luciferase（the control group was Lenti-LacZ-Luciferase）was constructed using the LR recombination system．After hPDLSCs was transduced by Lenti-miR-210-Luciferase，the analysis of HIF-1αand VEGF expression was done with qPCR and the immunohistochemistry examination．ResultsThe results of plasmid sequencing and digestion confirmed that the vector Lenti-miR-210-Luciferase was successfully constructed．After Lenti-miR-210-Luciferasewas transduced to hPDLSCs on 0，1，4，7 and 14 d，the results of qPCR showed that the over-expression of HIF-1αand VEGFwas detected on 4 d，and continued until21 d．Immunohistochemical results showed that after hPDLSCswere transduced by Lenti-miR-210-Luciferase，hPDLSCswere positive for HIF-1αand VEGF antibody，and the control group was negative．ConclusionThe Lenti-miR-210-Luciferase is successfully constructed，and miR-210 can promote hPDLSCs the differentiation of angiogenesis．

Key wordsperiodontal ligament stem cells；miR-210；hypoxia inducible factor-1α；vascular endothelial growth factor；lentiviral vector