LMO4的異位表達對NB4細胞增殖和分化的影響

秦　宇，陳瓊瓊，翟志敏，夏瑞祥，周海勝

LMO4的異位表達對NB4細胞增殖和分化的影響

秦宇1，陳瓊瓊1，翟志敏2，夏瑞祥3，周海勝1

摘要目的探討LMO4對急性早幼粒白血病細胞系NB4細胞增殖和分化的影響。方法利用qRT-PCR和Western blot法檢測NB4中LMO4表達；利用慢病毒介導LMO4的cDNA感染NB4細胞后，建立過量表達LMO4的NB4細胞株；采用MTT法檢測細胞增殖；使用全反式維甲酸（ATRA）誘導NB4細胞分化0～48 h，瑞氏染色觀察分化的細胞特性；流式細胞術分析NB4細胞分化后產生CD11b陽性的細胞比例。結果qRT-PCR和Western blot結果均提示NB4 中LMO4表達增加；ATRA誘導NB4分化時，LMO4的表達降低；MTT結果證實過量表達LMO4促進NB4增殖；瑞氏染色和流式細胞術結果均顯示，過量表達LMO4能夠促進ATRA誘導NB4細胞分化。結論LMO4參與調節NB4細胞的增殖，并能增加NB4細胞對ATRA的敏感性，促進其分化。

關鍵詞急性早幼粒細胞白血??；NB4；LMO4；全反式維甲酸

LMO4和LMO2同屬LIM基因家族成員，通過其特有的LIM結構域與其它轉錄因子相互作用，調節基因的轉錄，參與調控細胞增殖和分化等［1］。研究［2］表明LMO2參與調控早期紅系細胞的發育和分化；研究［3］顯示定位于人11號染色體的LMO2發生易位突變t（11；14）（p13；q11），導致T淋巴細胞內LMO2基因的異位激活而異常表達，誘發T細胞型急性淋巴細胞白血病。而LMO4廣泛表達于胚胎組織和成體組織［4］；在乳腺癌組織中LMO4表現為高表達［5］。但是，由于LMO2和LMO4結構上的高度同源性，因此兩者都能與共同的轉錄因子LIM結構域結合蛋白1（LIM domain binding protein 1，LDB1）組成蛋白復合體共同調控目的基因表達［6］。LMO4蛋白可能存在類似LMO2蛋白的功能，參與造血細胞的發生、發育和分化。早在2006年Meier研究團隊在對小鼠紅系白血病細胞系MEL細胞的研究［7］中同時得到與LDB1結合的LMO2蛋白復合體和LMO4蛋白復合體；同時證實LMO4蛋白復合體參與了調控斑馬魚后期造血細胞發生。而有關LMO4對人造血細胞增殖和分化等方面的作用，目前鮮有報道。該研究選擇急性早幼粒白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）細胞系NB4作為研究對象，研究LMO4在其分化過程中表達規律以及LMO4的過量表達對NB4細胞增殖和分化的影響。

1　材料與方法

1．1細胞株和載體

NB4細胞由上海交通大學陳字博士惠贈。含人LMO4基因cDNA表達框的慢病毒表達載體GV287-LMO4購自上海吉凱基因公司。

1．2試劑

RPMI-1640細胞培養基、100×青霉素鏈霉素雙抗混合液、PBS均購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Taq酶、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒、SYBR熒光定量試劑盒、DNA Marker購自日本TaKaRa公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；兔源抗體LMO4單克隆抗體；β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；PE標記CD11b抗體購自美國BD公司；HRP標記的IgG羊抗鼠、羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司；全反式維甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）購自美國Sigma公司；氯化硝基四氮唑藍（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、佛波醋酸酯（tetradecanoylphorbol acetate，TPA）、SDS-PAGE凝膠試劑盒購自上海碧云天公司；Annexin V-APC／PI試劑盒購自美國eBioscience公司。

1．3方法

1．3．1引物設計

根據NCBI數據庫查詢基因組序列，使用在線Primer-BLAST引物設計軟件設計檢測用引物，內參基因 β-actin（Genbank號：NM＿001101）上游引物：5′-TGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物：5′-AAGGGTGTAACGCAACTAA-3′，PCR產物為302 bp；LMO4（Genbank號：NM＿006769．3）上游引物：5′-CGGACCGCTTTCTGCTCTAT-3′，下游引物：5′-CACTCGCAGGAATCGACTGT-3′，PCR產物

2015－06－02接收

1．3．2細胞培養NB4細胞系用含10%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養基于5%CO2、37℃培養。為體外誘導NB4細胞分化，培養基中加入1μmol／L ATRA分別作用0、24、48、72 h，收集細胞，提取總蛋白，進行Western blot分析。

1．3．3建立穩定過表達LMO4的NB4細胞株

利用含有人LMO4基因cDNA表達框的慢病毒表達載體GV287-LMO4，按照常規包裝病毒，載體自帶綠色熒光蛋白基因。病毒采用復感染指數（multiplicity of infection，MOI）值為10的條件感染NB4細胞，72 h后觀察綠色熒光強度，獲得穩定細胞克隆，擴大培養并保存細胞。設置實驗分組：正常NB4細胞為對照組；轉入LMO4基因的NB4細胞為實驗組。

1．3．4qRT-PCR法檢測

根據參考文獻［8］操作如下：根據TRIzol Reagent說明書提取細胞的總RNA，按照逆轉錄酶說明書操作進行逆轉錄，獲得cDNA，以此為模板進行PCR。PCR反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，32個循環，最后72℃繼續延伸7 min，反應終止。PCR產物經1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進行qRTPCR檢測，實驗重復3次。

1．3．5Western blot法檢測

根據參考文獻［9］，收集細胞，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解30 min，100℃水浴煮沸10 min使蛋白變性。Bradford法分析蛋白濃度，10%SDS-PAGE中分離蛋白，恒流200 mA、1．5 h將蛋白濕轉到PVDF膜上。5%脫脂奶粉的TBST封閉40 min，孵育一抗兔抗LMO4抗體（1∶2 000稀釋）、鼠抗β-actin抗體（1 ∶3 000稀釋），4℃過夜，次日1%TBST洗膜，室溫孵育二抗（1∶5 000稀釋）6 h，洗膜，增強化學發光法X線片曝光顯影。

1．3．6MTT法檢測

取對數生長期的細胞，制備細胞懸液，調整細胞濃度為2．5×104／m l；每孔加入100μl細胞懸液，分別培養12、24、48、72 h；每孔加入10μl MTT溶液（5 mg／ml），于37℃繼續孵育4 h；每孔加入100μl的甲臜（Formanzan）溶解液，在培養箱內繼續孵育，直至在普通光學顯微鏡下觀察發現甲臜藍紫色結晶全部溶解，用酶標儀在490 nm測定光密度（optical density，OD）值，計算兩種細胞間增殖是否有差異，并作圖。

1．3．7NBT還原實驗檢測細胞分化

將細胞按照1×105／ml接種到6孔板，每孔加入ATRA（終濃度為1μmol／L），誘導分化NB4細胞，分別在12、24、48 h收集細胞，計數。取500μl細胞懸液加入12孔板，加0．5 ml NBT反應液（0．2%NBT、100μg／ml TPA），37℃培養30min，拍照。計數200個細胞，重復5次，計算NBT陽性率。NBT陽性率（%）＝（NBT陽性細胞數／細胞總數）×100%。

1．3．8流式細胞術檢測分化

將對數期細胞接種于6孔板，加入1μmol／L ATRA誘導分化；分別收集0、12、24、48 h的細胞，1 000 r／min離心5 min；PBS洗滌1次，100μl PBS重懸細胞后加入PE標記的CD11b抗體10μl，4℃避光孵育30 min；PBS洗滌1次，加400μl PBS重懸細胞，進行流式細胞術分析。

1．4統計學處理

2　結果

2.1NB4細胞分化過程中LMO4表達

結果顯示LMO4在未分化的早幼粒細胞中具有較高的表達；經過ATRA誘導后，NB4細胞中LMO4的表達降低，與0 h比較，差異有統計學意義（t＝10．579、7．594、5．226，P＜0．01），見圖1。

2.2過量表達LMO4的NB4細胞株的建立

為了進一步研究LMO4對NB4細胞增殖和分化的影響，擬建立穩定過量表達LMO4的NB4細胞株（NB4／LMO4）。選用含有人LMO4基因cDNA的慢病毒感染NB4細胞。感染48～72 h后，熒光顯微鏡觀察綠色熒光，細胞陽性率在90%以上（圖2）。收集對數生長期的NB4和NB4／LMO4細胞，分別提取總RNA和蛋白。利用總RNA進行qRT-PCR分析，結果顯示過量表達LMO4的NB4／LMO4細胞中LMO4基因的mRNA水平較對照NB4細胞明顯增高，差異有統計學意義（t＝21．92，P＜0．01），見圖3；Western blot顯示NB4／LMO4細胞株中LMO4蛋白比正常NB4細胞明顯增高，見圖4。已成功構建過量表達LMO4的NB4細胞株。

2.3過量表達LMO4對NB4細胞增殖的影響

采用MTT法檢測LMO4過量表達對NB4細胞增殖的影響。接種NB4細胞和NB4／LMO4細胞，分別測定12～72 h的OD490值。與對照組NB4細胞比較，增殖24 h時過量表達LMO4的NB4細胞增殖速度明顯增加，差異有統計學意義（t＝3．124，P＜0．05），48 h和72 h時，兩者的增殖速度差異有統計學意義（t＝10．562、6．495，P＜0．01），見圖5。過量表達LMO4促進NB4細胞增殖。

2.4過量表達LMO4對ATRA誘導NB4細胞分化的影響

NB4細胞在ATRA誘導下分化為成熟的粒細胞，其特異性標記分子CD11b高表達；且在NBT還原實驗中細胞內可見藍黑色顆粒。選擇NB4細胞和NB4／LMO4細胞，利用ATRA分別誘導12、24、48 h，結果顯示NB4／LMO4細胞顯示藍黑色的陽性率分別為7．8%、15．1%、21．3%，而對照組NB4細胞的分化陽性率分別為1．3%、6．3%、15．2%，兩者比較差異有統計學意義（t＝5．719、6．361、3．555，P＜0．01），見圖6、7；為進一步證實LMO4的過量表達對NB4細胞分化的影響，利用流式細胞術分析成熟粒細胞的標記分子CD11b＋細胞的比例。結果顯示，誘導分化12、24、48 h，過量表達LMO4的NB4細胞中，CD11b＋細胞分別為11．9%、32．4%、66．0%；而對照組NB4細胞中CD11b＋細胞分別為 3．45%、15．3%、43．7%（圖8）?？梢奀D11b＋細胞隨著誘導時間增加而增加，過量表達LMO4時，有利于促進NB4的分化。

3　討論

APL是急性髓細胞白血病的M3亞型，大多數APL患者是由于t（15；17）染色體發生移位導致維A酸受體（RARα）與早幼粒細胞白血病基因（promyelocytic leukemia，PML）形成PML-RARα融合基因，進而編碼PML-RARα融合蛋白。這種融合蛋白通過顯性負抑制作用抑制早幼粒細胞分化成熟并促進細胞增殖，其主要特點是骨髓和外周血中有大量未分化成熟的早幼粒白血病細胞［10］。目前臨床多采用ATRA和三氧化二砷聯合治療APL，前者作用機制是誘導早幼粒細胞分化成熟；后者主要作用機制是誘導白血病細胞凋亡［11］。NB4細胞是早期從APL患者分離出來的永生化的細胞系，在體外可以通過ATRA誘導其分化變成成熟粒細胞，表現為NBT還原實驗顯示陽性、CD11b＋等特點；同時在體外使用三氧化二砷可以誘導其發生凋亡。因此，NB4細胞常常作為研究造血細胞分化和增殖的細胞模型［12］。

人LMO4基因定位于1號染色體，其編碼產物LMO4蛋白是一種調控上皮細胞分化和增殖的重要轉錄因子，與LMO2蛋白具有高度同源性，都具有2個串聯LIM結構域，在細胞核內同樣發揮橋分子的作用，通過以LDB1蛋白為核心組成的蛋白復合體，結合協同調節不同轉錄因子的活性，在造血細胞分化過程中發揮了重要作用［13］。Meier et al［7］在小鼠白血病細胞系中已經證實了LDB1與LMO4結合形成一種大蛋白復合體，同時結合了LMO2、細胞周期蛋白依賴性激酶9（cyclin-dependent protein kinase 9，CDK9）等多種轉錄因子。這種大蛋白復合體存在于未分化狀態細胞并維持細胞的增殖；當細胞發生分化時，大蛋白復合體發生解聚失去CDK9而形成LDB1-LMO2-LMO4為核心的小蛋白復合體，調控細胞分化。研究［8］證實在成血管細胞中過量表達LMO2，促進成血管細胞增殖，同時在誘導分化時也促進造血細胞分化，特別是有利于紅系細胞的分化；而對于粒系、髓系和單核系血細胞形成作用不明顯。

本研究顯示LMO4在早幼粒細胞中高表達；利用ATRA誘導NB4細胞分化后，LMO4表達降低，提示LMO4參與調節NB4的增殖；在分化過程中LMO4具有負調控作用。通過建立過量表達 LMO4 的NB4細胞株并進行MTT實驗，結果證實，與對照組NB4細胞比較，過量表達LMO4，促進NB4的增殖。利用ATRA誘導分化NB4細胞，NBT還原實驗結果顯示過量表達LMO4時，藍黑色細胞比例較對照組細胞明顯增加；流式細胞分析同時也證實過量表達LMO4的NB4在誘導分化后產生CD11b＋細胞的比例較對照組明顯增高。因此，異位過量表達LMO4，可能在誘導分化時，導致大蛋白復合體的解離形成小蛋白復合體，從而增加了NB4細胞對ATRA的敏感性，有利于NB4細胞的分化。盡管臨床同時使用三氧化二砷治療APL，以促進白血病細胞的凋亡，但與對照組NB4細胞比較，過量表達 LMO4時，三氧化二砷誘導細胞凋亡的作用沒有明顯變化（結果未示）。因此，LMO4在NB4細胞高表達可能導致APL的白血病細胞過度增殖；同時也可能是臨床使用ATRA治療APL而增加白血病細胞對ATRA敏感性，有利于未成熟的原始幼稚粒細胞分化和成熟，其調控的分子機制有待進一步研究。

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中圖分類號R 34；R 733．71

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1394－06

基金項目：國家自然科學基金（編號：81172591）

作者單位：1安徽醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，合肥2300322安徽醫科大學第二附屬醫院血液科，合肥2306013安徽醫科大學第一附屬醫院血液內，合肥230022

作者簡介：秦宇，男，碩士研究生；周海勝，男，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：haishengs＠ahmu．edu．cn為201 bp。引物由上海生工生物公司合成。

Ectopic expression of LMO4 regulates NB4 cells proliferation and differentiation

Qin Yu1，Chen Qiongqiong1，Zhai Zhimin2，et al
（1Dept of Biochemistry and Molecular Biology，School of Basic Medicine，AnhuiMedical University，Hefei230032；2Dept of Hematology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230601）

AbstractObjectiveTo investigate potiential functions of LMO4 in regulating proliferation and differentiation of acute promyelocytic leukemia cells（NB4）．MethodsThe expression of LMO4 in the acute promyelocytic leukemia cell line（NB4）was detected using qRT-PCR and Western blot，respectively．Depending on lentivirus transduction，NB4 cellswith overexpression of LMO4 were established．The MTT assay was performed to detect proliferation；NB4 cells were induced by all trans retinoic acid（ATRA）to differentiate into mature granulocytes，which could be detected by using NBT testor flow cytometry for analysis of CD11b＋cells．ResultsWestern blotanalysis showed that LMO4 ectopically expressed in NB4 cells，and expression level of LMO4 decreased during differentiation induced by ATRA．After transduced by lentivirus containing human LMO4 cDNA，the NB4 cell line with LMO4 overexpression was obtained according to detection of LMO4 expression using qRT-PCR and Western blot analysis．Compared to the control cells，the MTT assay showed LMO4 overexpression in NB4 cell could improve cells proliferation；meanwhile，both NBT tests and flow cytometry analysis indicated that LMO4 overexpression could also increase NB4 differentiation efficiency depending on ATRA induction．ConclusionEctopic expression of LMO4 in NB4 cells promotes cell proliferation，and increases differentiation potency of NB4 cells due to being available of sensitiveness to ATRA．

Key wordsacute promyelocytic leukemia；NB4；LMO4；ATRA