結核分枝桿菌特異性蛋白片段Rv3388和6種特異抗原在結核抗體檢測中的應用價值

周　鵬，丁瑩瑩，林子玉，馮嬌嬌，高彩霞，王錦紅，楊　華，溫宗梅，潘　衛(wèi)，鄧松華，3

結核分枝桿菌特異性蛋白片段Rv3388和6種特異抗原在結核抗體檢測中的應用價值

周鵬1，丁瑩瑩2，林子玉1，馮嬌嬌2，高彩霞2，王錦紅2，楊華1，溫宗梅1，潘衛(wèi)2，鄧松華1，3

摘要目的對結核分枝桿菌（MTB）PE家族的所有成員的結構進行分析，預測其抗原表位，截取Rv3388蛋白的優(yōu)勢抗原片段，對重組Rv3388蛋白及其它6種MTB特異性抗原進行評估，探討不同結核特異性抗原與血清抗體的反應模式，評價血清學檢測在結核病診斷中的價值。方法利用基因合成技術重疊延伸PCR擴增Rv3388蛋白637～731位的編碼基因片段，原核表達并純化重組蛋白pET32a／Rv3388637-731，將純化的重組蛋白免疫BALB／c小鼠，采用間接ELISA法對該抗血清進行免疫原性分析。同時對這7種MTB特異性蛋白的特異性及敏感性進行評價。結果重組蛋白pET32a／Rv3388637-731在大腸桿菌中的表達量占全菌蛋白的80%，ELISA顯示有較強的免疫原性。7種MTB特異性抗原具有不同的反應模式，單個抗原檢測敏感性較差。結論對MTB PE家族的蛋白結構分析，表達并純化重組蛋白pET32a／Rv3388637-731，7種蛋白在血清抗體檢測中具有抗原互補性，不同抗原與機體反應存在不同反應模式，提高結核抗體檢測敏感性應多種抗原聯合檢測。

關鍵詞結核分枝桿菌；Rv3388；ELISA；特異性；敏感性

結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）俗稱結核桿菌，是引起結核病的致病菌，目前仍然是一種高死亡率的慢性傳染性疾病。2011年統(tǒng)計數據［1］顯示全球新發(fā)結核病患者達900萬之多，約有140萬人死于結核病。目前常用的肺結核診斷技術如痰涂片、結核菌培養(yǎng)都很難滿足臨床需要，早期、快速、精確診斷結核病是一個難點，也是一個熱門課題。1998年MTB全基因組測序工作完成［2］，通過對MTB蛋白質組學的研究［3］，各種MTB特異性蛋白抗原不斷被研究發(fā)現，為結核抗體的檢測奠定了良好的基礎。在血清抗體檢測中，ELISA法以其簡單、快速、靈敏等優(yōu)點在臨床檢驗方面被推廣應用［4］。該研究旨在通過分析MTB家族蛋白結構特性，預測其優(yōu)勢抗原表位，表達其具有抗原表位的片段，評價與其它6種MTB特異性蛋白（16KD、38KD、ESAF-6、CFP-10、MPT64、11488）作為血清學檢測靶標的應用價值，探討其反應模式。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1血清與蛋白來源80例結核病患者血清來自上海市肺科醫(yī)院，96例健康者血清來自第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院血液科。16KD、38KD、ESAF-6、CFP-10、MPT64，11488蛋白來自上海市肺科醫(yī)院。

1．1．2載體和菌株宿主菌大腸桿菌（E．coli）TOP10，E．coli BL21（DE3）及其原核表達載體pET32a均由第二軍醫(yī)大學病原生物學教研室保存。pMD-18T載體（T載體）購自日本TaKaRa公司。

1．1．3酶與主要試劑Taq DNA聚合酶購自上海申能博彩公司羊抗人IgG-HRP和羊抗鼠IgG-HRP購自上海華美生物公司；質粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒均購自上海生工生物有限公司；限制性內切酶EcoR I和Sal I、DNA分子量Marker DL 2 000、TA克隆試劑盒均購自日本TaKaRa公司；高效連接液（ligation high，LH）購自日本TOYOBO公司。

1．2方法

1．2．1生物信息學分析利用DNASTAR（7．1．0）軟件對MTB PE家族99個成員的氨基酸結構進行分析，顯示其家族氨基酸序列富含了大量GGXGG序列，本研究選取了其中一個家族成員 Rv3388進行分析，截取了親水性高的以GGNGG為主的一段序列進行全基因合成。序列如下：VGATGGNGGSGI GPASVGGNGGKGGVGAAGGLAGQIGNGGSGGSGGAGGNGGTGDTAGNGGNGGAGAVGGNAQLIGNGGNG-

2015－06－02接收

2第二軍醫(yī)大學病原生物學教研室，上海2004333安慶醫(yī)藥高等專科學校，安慶246052

1．2．2引物設計與合成

1．2．2．1全基因體外合成引物序列

根據Gene-Bank（GeneBank：YP＿177968．1 GI：57117101）中MTB標準株序列以及大腸桿菌的偏好密碼子設計并且合成了4對重疊互補引物，用以重疊延伸（over-lap extension，OE-PCR）體外合成Rv3388637-731序列。上游引物分別命名為U1、U2、U3、U4；下游引物分別命名為D1、D2、D3、D4；每條引物長約51 bp，引物之間相互重疊區(qū)域包含18個互補堿基，全基因序列全長282 bp［5］。

1．2．2．2表達載體構建用引物設計

將Rv3388637-731序列經大腸桿菌密碼子優(yōu)化后，設計一對用于PCR擴增目的序列的上下游引物，同時分別在上游引物（F1）增加了EcoR I的酶切位點（GAATTC）和6個酶切位點保護堿基。下游引物（R1）在末端增加Sal I的酶切位點（GTCGAC）和6個酶切位點保護堿基。以上所有引物采用DNAMAN V6軟件進行分析和評價，由上海杰李生物有限公司合成。具體引物序列見表1。

表1　全基因合成　Rv3388637-731和擴增編碼　DNA的引物序列

1．2．3Rv3388637-731DNA的全基因合成，克隆及序列測定

采用設計合成的4對重疊互補引物，利用OE-PCR的方法，分三輪體外合成編碼Rv3388637-731的序列。第一輪PCR反應體系，總反應體積25μl包括：每對互補重疊引物，U1／D1，U2／D2，U3／D3，U4／D4，引物濃度為20μmol／L，Taq DNA聚合酶以及對應反應Buffer。OE-PCR反應條件：94℃預變性10 min，94℃變性30 s，60℃退火35 s，72℃延伸30 s，總共35個循環(huán)，72℃延伸10 min；第一輪反應產物分別命名為U1D1、U2D2、U3D3、U4D4。第二輪PCR以第一輪產物兩兩為模板，采用片段頭尾核酸為引物，如以U1D1和U2D2為模板，以U1和D2作為上下游引物擴增片段U1D2，PCR程序和反應體系同第一輪，具體合成步驟見圖1，將最后一輪PCR產物經DNA凝膠回收并純化后克隆到pMD-18T載體中，按照試劑盒說明書進行操作。16 h后轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞E．coli TOP10，轉化后固體培養(yǎng)基上的單克隆（任意挑取10個）進行PCR鑒定及測序鑒定（由上海杰李生物有限公司進行序列測定，下同）。

1．2．4Rv3388637-731的擴增以及克隆

以上述測序正確的陽性質粒為模板，分別以F1／R1為上下游引物（引物濃度10μmol／L），PCR擴增Rv3388637-731目的序列，PCR反應條件同上。將DNA凝膠切膠回收純化后的產物克隆至pMD-18T載體中。對轉化后固體培養(yǎng)基上的單克隆（任意挑取10個）進行PCR鑒定及測序鑒定后，測定正確的質粒命名為pMD-18T-Rv3388637-731。

1．2．5Rv3388637-731原核表達載體的構建

分別以鑒定正確的pMD-18T-Rv3388637-731為模板，以F1和R1為上下游引物進行PCR擴增，反應體系條件均同前。PCR產物回收純化后使用限制性內切酶EcoR I和Sal I進行雙酶切，37℃作用3 h，DNA膠回收純化酶切后產物。與此同時，原核表達質粒pET32a用同樣方法進行雙酶切，純化回收酶切產物。將兩種酶切產物在LH的作用下16℃連接反應16 h。將連接產物轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞E．coli TOP10，取200μl涂布于含Amp（100μg／ml）的2YT平板上。挑取平板上5個單克隆擴大培養(yǎng)，用S．Tag和T7ter兩種通用引物行PCR鑒定，挑選鑒定正確的質粒進行DNA測序，將測序正確的質粒命名為pET32a／Rv3388637-731。

1．2．6pET32a／Rv3388637-731融合蛋白的誘導表達及純化

選取測序正確的pET32a／Rv3388637-731重組陽性質粒轉化至感受態(tài)細胞E．coli BL21（DE3）中，任意挑取固體培養(yǎng)基上3個單克隆培養(yǎng)過夜，次日分別轉接50μl至3 m l2×YT培養(yǎng)液（Amp 100 mg／m l＋Kana 35 mg／ml）中，設置1管對照，4 h后每管3 μl加入IPTG（1 mmol／L）小量誘導表達（對照管不加），誘導4 h后收集細菌培養(yǎng)液1 ml，12 000 r／min離心1 min，棄去上清液，沉淀中加入100μl 2× SDS上樣緩沖液，100℃煮沸10 min后12 000 r／min離心1 min，取上清液上樣。收集未經IPTG誘導的菌液以相同的方法制成SDS樣品。12%SDS-PAGE鑒定表達結果。經SDS-PAGE證實的陽性表達菌種用作大量誘導表達。取表達菌pET32a／Rv3388637-731／BL21，以1∶1 000轉接于 50 ml LB培養(yǎng)液（Amp 100 g／ml＋Kana 35 g／ml），37℃、250 r／min過夜后，以1∶100轉接于450 ml LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)至吸光度（absorbance，A）值A600為0．6時，加IPTG至終濃度1 mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后離心，棄上清液，菌體用PBS（pH＝7．2）溶解，超聲破碎后12 000 r／min離心10 min，收集上清液與沉淀，上清液過Ni-NTA柱進行蛋白純化，分別用10、20、100、300 mmol／L咪唑進行洗脫，分別收集洗脫液，進行SDSPAGE電泳檢測。

1．2．7小鼠免疫及抗血清制備

選BALB／c小鼠5只，第1次免疫使用pET32a／Rv3388637-731蛋白樣品（含量0．35～0．40 mg）與弗氏完全佐劑等體積混合，多點注射小鼠皮下及四肢，每只小鼠注射0．5 ml。2周后將蛋白樣品（蛋白含量0．30 mg）與弗氏不完全佐劑等體積混合進行2次免疫。以后每隔2周免疫1次，方法及劑量均同第2次。4次免疫后，經眼球動脈大量取血，約1 ml／只，12 000 r／min離心10 min，取上層血清，－40℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．8pET32a／Rv3388637-731蛋白的免疫原性分析

采 用ELISA 法，將pET32a／Rv3388637-731，PEPTIDE／Rv3388637-731和pET32a3種蛋白分別用50 mmol／L碳酸鹽緩沖液（pH＝9．6）包被于96孔酶聯反應板上，100μl／孔，37℃孵育3 h，用10%脫脂奶粉于37℃（200μl／孔）封閉過夜后，每孔加入倍比稀釋的免疫小鼠抗pET32a／Rv3388637-731血清（工作濃度1∶20），37℃孵育1 h，Tris-Tween洗板3次；加入羊抗鼠IgG-HRP（1∶2 000稀釋）100μl／孔，37℃孵育l h，Tris-Tween漂洗5次后經四甲基聯苯胺（TMB）顯色后用酶標儀于450 nm波長處測定A450值，以高于空白對照A450值2倍的數值作為陽性判斷標準，使用免疫前小鼠血清作為空白對照。

1．2．97種MTB特異性蛋白的血清學分析

為了分 析pET32a-Rv3388637-731、16KD、38KD、ESAF-6、CFP-10、MPT64、11488這7種蛋白在血清學檢測中的特異性、敏感性以及各抗原的反應模式，將這7種蛋白及載體蛋白pET32a分別用50 mmol／L碳酸鹽緩沖液（pH＝9．6）包被于96孔酶聯反應板上，0．5 mg／孔，37℃孵育3 h，用10%脫脂奶粉于37℃（200μl／孔）封閉過夜后，Tris-Tween洗板4次；分別以健康者血清和結核患者血清為一抗（工作濃度1∶20），37℃孵育1 h，Tris-Tween洗板3次；以HRP標記的羊抗人IgG為二抗（工作濃度1∶2 000），37℃孵育1 h，Tris-Tween漂洗5次后經TMB顯色后用酶標儀于450 nm波長處測定A450值。將每一份待檢血清的A450值與臨界值比較，以陰性血清的平均值＋2倍標準差為臨界值，以A450值＞臨界值作為陽性判斷標準進行結果判定［6］。

1．3統(tǒng)計學處理

使用SPSS 17．0軟件進行分析，敏感性（%）＝（真陽性）／（真陽性＋假陰性）× 100%，特異性（%）＝（真陰性）／（真陰性＋假陽性）×100%。

2　結果

2.1Rv3388637-731的體外全基因合成、克隆及序列測定

利用OE-PCR的方法，體外成功合成了Rv3388637-731基因序列，經過3輪PCR擴增出與理論值282 bp大小相符合的目的片段（圖2），該目的片段切膠回收純化后，產物克隆至pMD-18T載體中，挑取10個單克隆用通用引物RVM和M13-47進行序列測定，測序結果經 DNASTAR（7．1．0）軟件分析，結果表明該合成的目的基因編碼的氨基酸序列與MTB基因組中對應區(qū)段的氨基酸序列完全一致。

2.2Rv3388637-731原核表達載體的鑒定

將Rv3388637-731片段與pET32a原核表達載體連接，獲得重組表達質粒，挑取5個單克隆，用S．Tag和T7ter兩種通用引物PCR鑒定，1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測測序結果證明質粒構建正確。見圖3。

2.3pET32a-Rv3388637-731的表達及純化

將pET32a-Rv3388637-731重組質粒轉化至宿主菌E．coli B121（DE3），用 IPTG小量誘導表達，12%SDSPAGE鑒定結果顯示：與對照管（未誘導）條帶比較，pET32a／Rv3388637-731誘導表達的條帶中出現相對分子質量為28 ku的條帶（圖4），符合理論值。用Ni-NTA柱純化pET32a／Rv3388637-731蛋白，經 12%SDSPAGE鑒定，純化后pET32a／Rv3388637-731蛋白為相對分子量為28 ku的條帶（圖5），與理論值相符。

2.4pET32a／Rv3388637-731蛋白的免疫原性分析

ELISA分析表明，抗鼠pET32a／Rv3388637-731抗血清與pET32a／Rv3388637-731蛋白和PEPTIDE／Rv3388637-731蛋白均呈特異反應，其抗體滴度分別為1∶32 000和1∶16 000，與pET32a表達蛋白反應較弱（圖6），說明該抗血清抗體主要是針對Rv3388637-731特異性片段。

2.5MTB 7種蛋白間接ELISA分析

以pET32a／Rv3388637-731、16KD、38KD、ESAF-6、CFP-10、MPT64、11488這7種蛋白為抗原分別檢測80例結核患者血清以及96例正常者血清，測定A450值＞陰性血清的平均值＋2倍標準差作為陽性結果（表2）。

表2　單個抗原和多個抗原聯合檢測血清敏感性與特異性結果

3　討論

目前結核病實驗室診斷的金標準是細菌學檢測，但檢出率低，培養(yǎng)周期長，繁瑣費時，不能用于快速診斷。血清學檢測是一種快速簡便的實驗室診斷方法，本實驗利用這種方法對7種MTB特異性抗原進行檢測，顯示不同類型的抗原在宿主體內表達的數量、種類各不相同，這是由于MTB抗原多而復雜，表現出不同的反應模式，單一抗原用于檢測不能符合臨床診斷要求。

1998年，MTB全基因組測序完成后，富含甘氨酸和丙氨酸的酸性蛋白質家族－PE家族首次被發(fā)現，因其N端都含有PE基序，因而得名［7］。RV3388編碼的PE-PGRS52屬于PE-PGRS蛋白亞家族，可能存在于MTB的菌膜及菌壁中，在MTB的抗原變異方面起主要作用［8－10］。本實驗通過分析PE家族99個成員的蛋白結構，顯示該家族富含大量以GGXGG基序的片段，但大部分以疏水性氨基酸組成，不利于原核表達，因此本實驗選取了一段親水性較高，以GGNGG為主的一段抗原表位集中區(qū)域，該片段能夠覆蓋整個PE-PGRS蛋白亞家族，原核表達此蛋白片段，純化蛋白表達產物，間接ELISA顯示有較高的免疫原性。以80例結核患者血清及96例正常者血清為樣本，通過間接ELISA法檢測該蛋白片段的抗原性，結果顯示pET32a／Rv3388637-731的特異性為 97．9%，敏感性為37．5%；與16KD、38KD聯合檢測后，敏感性明顯提高；這表明pET32a／Rv3388637-731作為單一抗原用于血清學檢測意義不大，但可以作為結核聯合診斷的備選抗原。

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中圖分類號R 392．1

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1404－06

基金項目：國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）（編號：ss2014AA021403）；國家自然科學基金項目（編號：30872405，30472050，30972632）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學病理生理學教研室，合肥230032

作者簡介：周鵬，男，碩士研究生；潘衛(wèi)，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：weipan＠yahoo．com；鄧松華，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：desoh＠126．comGGGGNGGTGADGT。

Assessment of the detection effect of specific protein fragment of Rv3388 and six kinds of antigens in tuberculosis antibody response

Zhou Peng1，Ding Yingying2，Lin Ziyu1，et al
（1Dept of Pathophysiology，Anhui Medical University，Hefei230032；2Dept of Medical Microbiology and Parasitology，The Second Military Medical University，Shanghai200433）

AbstractObjectiveTo analyze the structure of allmembers in the PE family of Mycobacterium tuberculosis（MTB）and predict the antigen epitope，we chose the dominantantigen fragments of Rv3388 protein and estimate the antigenicity of notonly the recombinant Rv3388 protein but aslo the other six kinds of specific antigens of MTB．To investigate the reaction model between the different tuberculosis specific antigen and serum antibody，and to evaluate the value of serologicaldetection in the diagnosis of tuberculosis．MethodsThe gene coding637～731 amino acid fragment of Rv3388 was amplified by over-lap extension-PCR．The prokaryotic expressed and purified recombinant protein pET32a／Rv3388637-731 was utilized to immunize BALB／c mice，and the immunogenicity of the antiserum and the specificity and sensitivity of seven kinds specific proteins of MTB were analyzed by indirect ELISA．Results

The amount of recombinant protein pET32a／Rv3388637-731 expressed in E．coli was 80%of the total protein．The results of ELISA showed strong immunogenicity．The reaction patterns of antigenswere differentwith each other，and the detection sensitivity of single antigen was poorer．ConclusionThe structure of allmembers in the PE family ofMTB is analysed，and the recombinant protein pET32a／Rv3388637-731 is expressed and purified successfully．Seven kinds ofproteins in the serum antibody are antigen complementary in the detection．Differentantigen is different reaction pattern．A variety of antigens should be jointly detected to improve the sensitivity of antibody detection of tuberculosis．

Key wordsMycobacterium tuberculosis；Rv3388；ELISA；specificity；sensitivity