鎘誘導小鼠急性肝損傷模型的研究

吳永琴，關存杰，劉洪茂，姬艷麗，徐德祥

鎘誘導小鼠急性肝損傷模型的研究

吳永琴1，關存杰1，劉洪茂2，姬艷麗2，徐德祥2

摘要目的通過腹腔注射氯化鎘（CdCl2）建立小鼠急性肝損傷模型，初步闡明其分子機制。方法以4 mg／kg CdCl2腹腔注射小鼠，觀察各時間點小鼠肝組織病理變化和血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）的變化，探索CdCl2引起明顯肝損傷的染毒時間；以1、2、4 mg／kg CdCl2對小鼠腹腔注射染毒，篩選出CdCl2誘導急性肝損傷的最佳染毒劑量；檢測血清丙二醛（MDA）以及肝勻漿MDA、一氧化氮（NO）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）含量，觀察氧化應激在CdCl2誘導的小鼠肝損傷中的作用。結果以4 mg／kg CdCl2腹腔注射18 h后，肝臟組織出現片狀壞死，肝細胞嚴重氣球樣變，血清ALT和AST明顯升高。此外，與對照組比較，CdCl2處理18 h后，血清與肝臟MDA及肝臟NO水平顯著升高，肝臟GSH、GSH-PX活性明顯降低。結論4mg／kg CdCl2腹腔注射18 h后可成功建立小鼠急性肝損傷模型，其發生可能與MDA和NO升高，肝組織GSH含量、GSH-PX活性降低相關。

關鍵詞氯化鎘；急性肝損傷；動物模型；MDA；NO；GSH

中毒性肝損傷是指藥物、外源性毒物及其代謝產物引起的肝臟損傷性病變，臨床上十分常見，發病率僅次于病毒性肝炎。目前常用的肝損傷動物模型包括三大類，即化學性肝損傷動物模型、免疫性肝損傷動物模型和藥物性肝損傷動物模型［1－2］。目前化學性急性肝損傷模型的研究［3－6］以對乙酰氨基酚、四氯化碳、酒精等的研究較為詳細，而對重金屬導致的急性肝損傷模型研究較少。重金屬誘導的肝損傷的分子機制可能與四氯化碳等誘導的肝損傷機制不同，對四氯化碳等誘導的肝損傷有效的保肝藥物是否適用于重金屬誘導的肝損傷也應該重新思考。鎘對機體許多組織器官都具有毒性作用［7］，肝臟是急性鎘暴露的主要靶器官之一。目前對鎘誘導小鼠急性肝損傷的研究［8－11］在劑量和時間上差異較大，且動物品系、性別不同，所誘導的肝臟毒性也有所不同［12］。該研究對氯化鎘（cadmium chloride，CdCl2）誘導的肝損傷進行動態觀察，篩選合適的染毒劑量及最佳染毒時間，建立鎘誘導的肝損傷模型，為進一步研究重金屬誘導的肝損傷分子機制及篩選保肝藥物提供參考依據。

1　材料與方法

1．1實驗動物

健康清潔級ICR小鼠（6～8周齡，雄性，體重28～35 g）購自安徽省實驗動物中心。實驗前適應性喂養1周，自由飲食，晝夜均衡，溫度20 ～25℃，濕度（50±5）%。實驗遵循國家科學技術部條件財務司頒布的《中華人民共和國實驗動物管理條例》，盡量減少實驗動物使用數量和減少實驗動物痛苦，禁止虐待動物。

1．2試劑

CdCl2購自美國Sigma公司；血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶 （aspartate aminotransferase，AST）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）和一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1．3動物處理

為動態觀察CdCl2誘導的急性肝損傷，鎘處理組小鼠以0．1 ml／10 g體重經腹腔注射4 mg／kg CdCl2，分別在處理6、12、18、24、48、72 h后剖殺。為探討鎘致小鼠急性肝損傷的劑量－效應關系，鎘處理組小鼠經腹腔注射不同劑量的CdCl2（1、2、4 mg／kg），鎘處理后18 h剖殺小鼠。正常對照組給予等容量生理鹽水。陽性對照組經腹腔注射給予300 mg／kg對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）并于4 h后剖殺［4］。收集血清用于生化指標檢測；取肝臟稱重后，取部分肝臟固定于 4%多聚甲醛溶液中，用于制備石蠟切片。其余肝臟組織儲存于－80℃，用于生化指標檢測。

1.4ALT、AST活力測定

采用改良賴氏比色法測定血清ALT、AST活力以評價肝臟損傷程度。遵

2015－05－08接收

1.5GSH含量及GSH-PX活力測定

采用Beutler改良法檢測肝組織GSH含量，Lowry法測定肝組織蛋白含量。GSH-PX活力測定參照試劑盒說明。

1．6脂質過氧化測定

通過測定脂質過氧化的羰基產物MDA水平來反映肝組織的氧化應激水平，MDA含量測定采用TBARS比色法。NO采用化學法測定。

1.7肝臟組織HE染色

取小鼠完整未破損的肝臟組織塊，置于4%多聚甲醛中固定。經無水乙醇溶液脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5μm連續切片、HE染色、光學樹脂封片，在光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學變化并拍照，每組分別制備不同小鼠HE染色切片，由安徽醫科大學第一附屬醫院病理科完成。

1．8統計學處理

2　結果

2．1急性鎘暴露對雄性小鼠體重及肝臟重量的影響

在染毒觀察期內沒有小鼠死亡。4 mg／kg CdCl2處理12 h后小鼠體重及肝臟絕對重量明顯下降，48 h后小鼠體重基本恢復，72 h后肝臟絕對重量恢復（F＝2．86、3．43，P＜0．05），見表1。不同劑量鎘暴露對小鼠體重及肝臟重量的影響（F＝3．23、3．94，P＜0．05），見表2。與正常對照組比較，4 mg／kg CdCl2暴露18 h后小鼠的體重和肝臟重量明顯下降。

表1　4mg／kg CdCl2對雄鼠體重、肝臟重量的影響（n＝6，±s）

表1　4mg／kg CdCl2對雄鼠體重、肝臟重量的影響（n＝6，±s）

與正常對照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

組別　　處理前體重（g）處理后體重（g）肝臟絕對重量（g）33．99±1．49　34．58±1．31　2．15±0．26 Cd－6 h　33．97±2．06　33．69±1．97　2．04±0．22 Cd－12 h　33．96±1．92　32．35±1．86*　1．72±0．09**Cd－18 h　34．46±2．41　32．04±1．74*　1．78±0．18**Cd－24 h　34．26±2．11　31．64±2．14*　1．59±0．12**Cd－48 h　34．42±3．50　32．36±3．64　1．71±0．26**正常對照Cd－72 h　33．47±3．43　32．45±3．67　1．83±0．36

表2　不同劑量　CdCl2對雄鼠體重、肝臟重量的影響（n＝6，±s）

表2　不同劑量　CdCl2對雄鼠體重、肝臟重量的影響（n＝6，±s）

與正常對照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

組別　　處理前體重（g）處理后體重（g）肝臟絕對重量（g）31．71±1．88　33．11±2．47　2．01±0．28 1 mg／kg CdCl2　31．35±2．53　31．91±2．79　1．62±0．35*2 mg／kg CdCl2　31．16±1．68　30．46±2．24*　1．69±0．18*4 mg／kg CdCl2　31．07±1．86　29．40±1．28**　1．65±0．14正常對照**

表3　4 mg／kg CdC l2對雄鼠血清ALT、AST的影響（n＝6，±s）

表3　4 mg／kg CdC l2對雄鼠血清ALT、AST的影響（n＝6，±s）

組別　ALT（U／L）　AST（U／L）20．25±4．16　22．33±6．48陽性對照　150．29±33．88**Cd－6 h　34．56±23．16　39．28±11．53 Cd－12 h　45．36±17．80**　48．83±12．37**Cd－18 h　222．12±119．9**　99．09±46．05**Cd－24 h　76．55±52．05*　56．35±15．04**Cd－48 h　45．50±17．19**　35．67±19．57 Cd－72 h　19．87±5．52　53．67±19．64正常對照**

與正常對照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

表4　不同劑量　CdC l2對雄鼠血清　ALT、AST的影響（n＝6，±s）

表4　不同劑量　CdC l2對雄鼠血清　ALT、AST的影響（n＝6，±s）

與正常對照組比較：*P＜0．05；**P＜0．01；與1 mg／kg CdCl2組比較：＃＃P＜0．01；與2 mg／kg CdCl2組比較：△△P＜0．01

組別　ALT（U／L）　AST（U／L）20．96±5．26　23．74±7．51 1 mg／kg CdCl2　29．73±17．09　38．47±11．58 2 mg／kg CdCl2　37．22±24．38　39．67±15．99*4 mg／kg CdCl2　148．56±45．37**＃＃　108．40±9．82正常對照**△△

2．2急性鎘暴露對雄性小鼠肝臟組織病理學的影響

正常對照組肝組織切片顯示肝小葉結構正常，肝細胞以中央靜脈為中心，向周圍呈放射狀排列，肝索和肝血竇清晰可見；陽性對照組肝小葉結構破壞，出現片狀壞死，肝竇淤血，肝細胞胞質淡染呈氣球樣變，胞核溶解，炎癥細胞浸潤。4 mg／kg CdCl2染毒后，肝組織病理損傷隨時間先逐漸加重，以18 h最為嚴重，肝組織切片出現片狀壞死，壞死區肝索紊亂，中央靜脈和部分肝竇淤血，肝細胞腫大呈氣球樣變，胞質淡染疏松化，胞膜破壞及胞核碎裂，炎癥細胞浸潤。1 mg／kg CdCl2劑量組肝組織肝小葉結構仍然保持正常；2 mg／kg CdCl2劑量組肝細胞排列輕微錯亂，部分區域出現肝細胞片狀變性，炎癥細胞輕微浸潤。見圖1、2。

2.3急性鎘暴露對血清ALT與AST的影響

APAP處理4 h后血清中ALT明顯升高，見表3。與正常對照組比較，4 mg／kg CdCl2處理12 h后血清ALT、AST明顯升高，18 h達最高峰，在鎘處理后24 h血清ALT、AST下降，72 h基本恢復正常（F＝4．89、4．43，P＜0．01）。此外，與正常對照組比較，1 mg／kg與2 mg／kg CdCl2僅引起ALT、AST的輕微升高，而4 mg／kg CdCl2處理18 h后的血清ALT、AST明顯高于其它兩個劑量組，差異有統計學意義（F＝15．6、50．2，P＜0．01）。見表4。

2．4急性鎘暴露對小鼠肝臟氧化應激指標的影響

與正常對照組比較，鎘暴露組小鼠血清MDA、肝臟MDA、肝臟NO水平隨時間逐漸升高（F＝5．33、6．40、8．16，P＜0．01），而且具有劑量效應關系（F＝6．46、14．42、13．30，P＜0．01），4 mg／kg CdCl2處理18 h達到高峰；而GSH含量及GSH-PX活力隨時間逐漸降低（F＝28．99、17．38，P＜0．01），于18 h達到最低點，72 h基本恢復正常，并具有劑量效應關系（F＝60．49、21．98，P＜0．01），見表5、6。

表5　4 mg／kg CdC l2對小鼠血清與肝臟氧化應激指標的影響（n＝6，±s）

表5　4 mg／kg CdC l2對小鼠血清與肝臟氧化應激指標的影響（n＝6，±s）

與正常對照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

組別　　血清MDA（nmol／ml） 肝臟MDA（μmol／gprot）　肝臟NO（μmol／gprot） 肝臟GSH（μmol／gprot）　　肝臟GSH-PX（U／L）正常對照　6．09±1．03　2．14±0．61　0．38±0．15　67．05±5．65　754．72±58．54 Cd－6 h　6．69±1．93　2．00±0．56　0．46±0．18　59．21±10．55*　692．23±36．97*Cd－12 h　10．02±3．03**　3．23±1．36**　0．65±0．22**　35．05±6．54**　601．48±27．06**Cd－18 h　10．54±1．87**　6．92±2．18**　1．17±0．39**　17．48±5．55**　529．41±37．40**Cd－24 h　8．63±1．55**　2．75±1．11　0．60±0．15**　38．63±6．28**　607．85±20．89**Cd－48 h　6．24±0．99　2．49±0．26　0．57±0．32　61．89±10．56　727．77±65．72 Cd－72 h　7．22±1．58　2．18±0．31　0．36±0．16　62．77±11．30　733．61±69．31

3　討論

近年來，隨著新藥、新化學物質的不斷出現和環境污染加劇，藥物中毒性肝損傷的發病率呈明顯上升趨勢。中毒性肝損傷的發病機制非常復雜，對其肝損傷的分子機制目前尚不清楚。選擇合適的肝損傷模型是探討中毒性肝損傷的發病機制、做好防治肝損傷研究的前提。鎘是環境中常見的有毒重金屬元素，肝臟是鎘急性中毒損傷的主要靶器官。本研究通過腹腔注射CdCl2建立小鼠急性肝損傷的模型。結果顯示：4 mg／kg CdCl2腹腔注射18 h后引起小鼠肝臟出現明顯的病理損傷，肝組織出現片狀壞死區，肝細胞呈嚴重氣球樣變，中央靜脈和肝竇淤血嚴重。

ALT和AST是一組催化氨基在氨基酸與α-酮酸間轉移的酶，是反映肝實質損害的主要酶類。當肝細胞被破壞、細胞膜通透性增高及線粒體損傷時，ALT和AST活力升高，酶活力的高低與肝細胞受損的程度相一致。本研究顯示：腹腔注射4 mg／kg CdCl2后，小鼠血清ALT、AST逐漸升高，18 h達到峰值，24 h明顯下降，72 h基本恢復正常。4 mg／kg CdCl2處理18 h后的小鼠血清ALT、AST明顯高于1、2 mg／kg劑量組。根據上述實驗結果，單次腹腔注射4 mg／kg CdCl218 h后能夠誘導成年雄性ICR小鼠發生急性肝損傷。

目前研究［2，12］顯示鎘離子對肝臟的毒性作用與氧化應激導致的脂質過氧化有關，鎘離子消耗GSH，與分子巰基蛋白結合，引起活性氧化物如超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等的增多。MDA是脂質過氧化反應的主要產物，其含量的高低間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。GSH-PX是體內廣泛存在的抗氧化酶，其活性的高低反映了機體抗氧化能力和清除自由基的能力，在細胞內起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。GSH是有效的巰基抗氧化劑，能有效防止脂質過氧化，從而減輕氧化應激。本實驗表明，在給予4 mg／kg CdCl212 h后小鼠血清與肝臟MDA升高，至染毒后18 h達峰值；而4 mg／kg CdCl2處理后肝臟GSH-PX活力與GSH水平顯著降低，至18 h達最低值，并呈明顯的時間－效應關系及劑量－效應關系。提示在本模型中，小鼠的肝臟受到了自由基的攻擊程度比較嚴重，自身的抗氧化及清除自由基的能力下降。NO是一種重要的細胞內第二信使，對肝細胞具有雙重作用，高濃度的NO通過多種機制導致肝細胞損傷或凋亡，也使肝細胞產生大量自由基，造成MDA升高［13－15］。本實驗結果顯示，單次腹腔注射4 mg／kg CdCl218 h后小鼠肝勻漿中NO的含量顯著升高，提示鎘引起肝臟氧化應激損傷。

綜上所述，本研究顯示，以4 mg／kg CdCl2腹腔注射18 h后可成功建立小鼠急性肝損傷模型，為探討重金屬類毒物誘導肝損傷的發生機制、篩選保肝藥物、探索保肝作用機制提供了實驗動物模型。

表6　不同劑量　CdC l2對小鼠血清與肝臟氧化應激指標的影響（n＝6，±s）

表6　不同劑量　CdC l2對小鼠血清與肝臟氧化應激指標的影響（n＝6，±s）

與正常對照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

組別　　血清MDA（nmol／m l）肝臟MDA（μmol／gprot）肝臟NO（μmol／gprot）肝臟GSH（μmol／gprot）　　肝臟GSH-PX（U／L）8．17±52．42 1 mg／kg CdCl2　7．10±1．68　1．93±0．62　0．43±0．33　50．12±8．70*　683．80±58．22 2 mg／kg CdCl2　7．85±1．83*　1．92±0．82　0．81±0．44*　40．31±6．56**　595．66±33．59**4 mg／kg CdCl2　10．00±1．66**　6．84±1．26**　1．15±0．31**　19．91±5．00**　525．16±41．34正常對照　6．13±0．76　1．88±0．32　0．36±0．11　66．09±6．05　72 **

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中圖分類號R 854；R 575

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1443－05

基金項目：國家自然科學基金（編號：31000664）；安徽醫科大學2011年博士科研資助項目（編號：XJ201114）；安徽醫科大學“青年拔尖人才支持計劃”，高等學校省級特色專業建設點項目（編號：2013tszy010）

作者單位：安徽醫科大學1第一臨床醫學院，2公共衛生學院，合肥230032

作者簡介：吳永琴，男，本科生；姬艷麗，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：jiyanlidev＠126．com照試劑盒說明書進行操作。

Establishment ofmousemodel of acute liver injury induced by cadm ium chloride

Wu Yongqin1，Guan Cunjie1，Liu hongmao2，et al （1The First School of Clinical，2School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo establish themousemodel ofacute liver damage induced cadmium chloride and elucidate themechanism of Cd-induced-liver injury．MethodsThe adultmale mice were intraperitoneally（i．p．）injected with a single dose of CdCl2（4 mg／kg）and killed at different time（6，12，18，24 h）after Cd treatment，or administrated with different doses of CdCl2（1，2 or 4 mg／kg）i．p．and sacrificed at18 h after Cd exposure．The control group received only equal volumes of normalsaline．Histopathology of liver tissues，serum of ALT，AST and MDA，and MDA，NO，GSH，GSH-PX of liver tissues were observed．Resu lts18 hours after the treatment of using 4 mg／kg dosage，i．p，liver tissues appeared visible pathological changes with severe ballooning degeneration and necrosis，the levels of ALT and AST in serum were obviously higher．In addition，at18 h after Cd treatment，the levels of MDA and NO in liver tissues significantly increased in the cadmium group，however，the level of GSH and the activity of GSH-PX in liver tissues significantly decreased．ConclusionA mouse model of acute liver injury is successfully established by intraperitoneal injection with 4 mg／kg CdCl2at18 hours after Cd treatment．Themechanism might be associated with the increase of MDA and NO and the decrease of the level of GSH and the activity of GSH-PX in liver tissues．

Key wordscadmium chloride；acute liver injury；animalmodel；MDA；NO；GSH