IL-17及其受體調控JAK／STAT3信號通路促進喉癌血管生成的作用

瞿　帥，宋　楊，梅金玉，曹　衛，陶　冶，王雅堂，楊見明

IL-17及其受體調控JAK／STAT3信號通路促進喉癌血管生成的作用

瞿帥，宋楊，梅金玉，曹衛，陶冶，王雅堂，楊見明

摘要目的探討白細胞介素17（IL-17）及其受體調控酪氨酸激酶（JAK）／轉錄激活因子-3（STAT3）信號通路促進喉癌血管生成的作用。方法收集喉癌手術切除標本70例，癌組織通過不同病理分級，采取70例喉癌患者的外周血。采用ELISA法檢測外周血中IL-17、血管內皮生長因子A （VEGF-A）的濃度，分析其與臨床病理特征的關系。Western blot法檢測喉癌組織中IL-17、IL-17受體（IL-17R）、JAK1／2、p-JAK1／2、STAT3、p-STAT3、VEGF-A、環氧合酶-2（COX-2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）等信號分子水平的變化。結果喉癌患者血清中IL-17、VEGF-A的含量與喉癌的分化程度、淋巴結有無轉移和TNM分期有關（P＜0．05），Western blot結果顯示在喉癌發展的不同時期，隨著喉癌的惡化，IL-17、IL-17R的表達逐漸增強，相關信號通路分子JAK1／2、p-JAK1／2、STAT3、p-STAT3、VEGF-A、COX-2、MMP-9表達也顯著增加。結論IL-17可能調控JAK／STAT3信號通路，在喉癌的血管生成中起到重要的作用。

關鍵詞IL-17；喉癌；JAK／STAT3

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，以鱗狀上皮細胞癌為主，其發病率約占全身惡性腫瘤的5．7%～7．6%［1］。研究［2］表明，血管生成是腫瘤侵襲轉移的關鍵因素，新生血管生成對于大多數實體瘤的發生發展，以及復發轉移都是必不可少的［2］。目前生物治療已成為一種備受關注的新型腫瘤治療方法，其中細胞因子基因治療是研究熱點［3］。白細胞介素17（interleukin 17，IL-17）主要由CD＋4記憶性T淋巴細胞、單核細胞等分泌［4］。通過與受體特異性結合，發揮促進炎癥發展、免疫排斥、造血等功能，在免疫調節和調控腫瘤細胞生長方面均有重要作用［5］，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體能特異地結合并在腫瘤新生血管生成過程中起著至關重要的作用。現已發現的VEGF家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子［6］。環氧合酶（cyclooxygenase，COX）是前列腺素生物合成的限速酶，有COX-1和COX-2兩種亞型，COX-2為誘導性表達基因，在前列腺癌、肺癌、消化道腫瘤中高表達［7］。基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteins 9，MMP-9）是MMPs中最重要的酶之一，腫瘤細胞的浸潤轉移能力與其產生蛋白酶降解細胞外基質和基底膜的能力密切相關［8］。該研究收集行喉癌手術切除的患者標本70例，采集外周血，探討IL-17及其受體（IL-17R）促進喉癌血管生成的作用和機制。

1　材料與方法

1．1病例資料

收集2008年3月～2013年3月于安徽醫科大學第二附屬醫院行喉癌手術切除的患者喉癌組織標本70例、癌旁組織和正常組織標本。喉癌組織分為低分化組、中分化組、高分化組和癌旁組。喉癌的分型分類、病理學分級及臨床分期按國際抗癌協會TNM分類標準修訂的方案統一進行分類。70例喉鱗狀細胞癌患者中，男51例，女19例；年齡43～75（60±13．88）歲；高分化21例，中分化30例，低分化19例；聲門上型15例，聲門型49例，聲門下型6例。

1．2血清的采集與保存

70例喉癌患者于接受手術治療前用干燥管采集空腹靜脈血液5 ml，室溫放置30 min，3 000 r／min離心15 min，吸取上清液并凍存于－20℃待測。喉癌患者的診斷需經細胞學或病理學檢查證實，為原發、初治的喉癌患者，抽血前未接受手術、放療、化療、分子靶向及免疫生物等治療。患者均知情并簽署知情同意書。

1．3試劑

兔抗人IL-l7、IL-17R單克隆抗體購自英國Abcam公司；酪氨酸激酶（janus kinase，JAK）1／2、p-JAK1／2、轉錄激活因子-3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）、p-STAT3、VEGF-A、MMP-9、COX-2抗體，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司；RIPA蛋白裂解液（強）、PMSF、BCA蛋白濃度檢測

2015－05－18接收

1.4ELISA法檢測血清中IL-17和VEGF-A的水平

采用ELISA法檢測受檢者血清中IL-17、VEGFA的水平。分別用抗人IL-17和VEGF-A單抗包被酶標板，采用標準品和樣品中的IL-17、VEGF-A與單抗結合，加入生物素化的抗人IL-17、VEGF-A抗體形成免疫復合物連接，與板上辣根過氧化物酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素與生物素結合。加入酶底物工作液，出現藍色后加入硫酸終止液。最后采用全自動酶標儀（芬蘭Thermo Labsystems公司）進行分析，根據標準曲線計算出待測樣品中的濃度值，乘以稀釋倍數得到最后結果。

1.5W estern b lot法檢測喉癌組織中IL-17、IL-17R、JAK 1／2、p-JAK 1／2、STAT3、p-STAT3、VEGF-A、MMP-9、COX-2等信號分子水平的變化

取各組喉癌組織150μg，加入200 ml新鮮配制的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），收集組織，4℃、13 000 r／min離心15 min，將上清液移至另一離心管中，取部分樣品用BCA法測定蛋白濃度。PVDF膜用TBST漂洗3次，每次5 min，加入含IL-17、IL-17R、JAK1／2、p-JAK1／2、STAT3、p-STAT3、VEGF-A、MMP-9、COX-2一抗的稀釋液，搖床上4℃孵育過夜，洗滌后，繼以辣根過氧化物酶結合的二抗室溫孵育2 h，ECL試劑盒顯色。用Image-Pro plus圖像處理系統分析計算蛋白印跡值。

1．6統計學處理采用SPSS 16．0軟件進行分析，計量資料用±s表示。兩組間均數的比較采用t檢驗，IL-17與VEGF-A相關關系采用線性相關分析。

2　結果

2.1喉癌患者血清中IL-17、VEGF-A含量與喉癌患者臨床特征的關系

IL-17、VEGF-A的含量與喉癌患者的分化程度、淋巴結有無轉移和TNM分期有關（P＜0．05），與年齡、性別、原發灶部位無關（P＞0．05）。見表1。

2.2喉癌患者血清IL-17水平與VEGF-A水平的相關性分析

相關分析結果表明，喉癌患者血清IL-17水平與VEGF-A水平呈正相關性（r＝0．88，P＝0．003）。見圖1。

表1　喉癌患者血清中　IL-17、VEGF-A的含量與臨床病理特征的關系（pg／m l，±s）

表1　喉癌患者血清中　IL-17、VEGF-A的含量與臨床病理特征的關系（pg／m l，±s）

項目　　例數　IL-17　P值　VEGF-A　P值年齡（歲）≤59　36　61．53±5．88　0．347　541．42±168．77　0．453 ＞59　34　59．30±4．37　564．94±164．31性別男68　62．03±5．27　0．53　572．92±168．82　0．462 女2　60．58±5．85　546．25±161．60原發灶部位聲門型　48　60．30±5．32　0．175　531．44±123．67　0．573非聲門型　22　61．96±5．98　571．43±93．51分化程度高22　79．65±5．19　0．018　698．16±140．10　0．015中、低　48　62．14±5．82　465．11±165．02有無淋巴結轉移有37　62．75±5．35　0．029　693．70±168．09　0．001 無33　50．28±5．68　513．38±166．11 TNM分期Ⅰ－Ⅱ　43　59．84±5．31　0．023　424．42±162．25　0．045Ⅲ－Ⅳ27　73．39±5．68　571．30±113．25

2.3IL-17對JAK／STAT3信號通路相關信號分子的調控

隨著喉癌的發生和發展，在不同的喉癌分化組，IL-17、IL-17R的表達逐漸增強，信號通路分子 JAK1／2、p-JAK1／2、STAT3、p-STAT3的表達也呈增強趨勢，VEGF-A、MMP-9、COX-2的表達隨著分化的程度逐漸增加，差異有統計學意義（P＜0．05）。見圖2。

3　討論

IL-17是主要由CD4＋記憶性T淋巴細胞、單核細胞等分泌的一種細胞因子，其在天然免疫和宿主防御中有特殊功能，在免疫調節和調控腫瘤細胞生長方面均有重要作用［9］。研究［10－12］顯示，IL-17是參與機體免疫監視和調控的重要分子，在腫瘤微環境中具有促進血管生成和腫瘤生長轉移等作用，IL-17在多種腫瘤組織中都呈現高表達，如前列腺癌、胃癌、原發性肝癌等。本研究結果顯示，喉癌患者血清中IL-17的含量與喉癌患者的分化程度、淋巴結有無轉移和TNM分期有關（P＜0．05），與年齡、性別、原發灶部位無關，這提示IL-17的表達可能在腫瘤發展中起到重要作用。腫瘤血管生成取決于促血管生成和抗血管生成因子之間的平衡。VEGF及其受體是最重要的促血管生成因子。其中VEGF-A發現最早、研究最深入、表達最廣泛、含量最高［6］。本實驗中，喉癌患者血清中VEGF-A的含量與喉癌患者的分化程度、淋巴結有無轉移和TNM分期有關（P＜0．05），與年齡、性別、原發灶部位無關，提示VEGF-A的表達與喉癌淋巴結轉移密切相關。相關性分析結果表明，喉癌患者血清中IL-17的水平與VEGF-A水平呈正相關性（P＝0．003），研究［10］顯示，輔助性T細胞17分泌的 IL-17與纖維細胞表面的IL-17R結合后，刺激纖維細胞產生多種促血管新生因子，形成新的脈管系統，其中最重要的因子就是VEGF。本實驗結果提示喉癌的發生發展中IL-17與新生血管形成有密切關系。

IL-17被證實能夠選擇性的增強腫瘤細胞與內皮細胞中促血管作用。IL-17在眾多的腫瘤細胞中介導不同的信號轉導途徑，如有絲分裂原活化的蛋白激酶，核轉錄因子-κB和STAT3途徑［12］。研究［13］顯示，由于IL-17RA可在多種腫瘤細胞表達，因此IL-17也可作用于多種腫瘤細胞，IL-17對靶細胞的作用主要是通過調控IL-17RA下游靶基因表達。研究［14］顯示，在肝癌細胞中，IL-17可以通過JAKS／STATs途徑傳導信號調節腫瘤細胞的浸潤和轉移，IL-17可以誘導JAK1／2／3、TyK2以及STAT1 ～4的磷酸化活化，其中JAK2最為重要，活化的STAT自胞質進入胞核，促進各種因子的轉錄。研究［15］表明IL-17可以通過激活AKT信號，導致IL-6的產生。繼而激活JAK2／STAT3信號，隨后上調其下游靶IL-8、MMP-9和VEGF。

本研究顯示，隨著喉癌的發生和發展，IL-17，IL-17R的表達逐漸增強，信號通路分子JAK1／2、p-JAK1／2、STAT3、p-STAT3的表達也呈增強趨勢，VEGF-A、MMP-9、COX-2的表達隨著分化的程度逐漸增加，差異有統計學意義（P＜0．05），研究［7］顯示，COX-2在許多良性癌前病變和惡性腫瘤中均有高表達，且可能對細胞調亡、血管形成和免疫抑制有影響，COX-2還誘導MMPs表達，降解細胞外基質，促進腫瘤的轉移。本實驗表明IL-17結合IL-17R可能通過對JAK／STAT3信號通路調控VEGF-A、MMP-9、COX-2的表達。提示IL-17在喉癌的發生發展中起到重要的作用，IL-17可能調控JAK／STAT3信號通路，在喉癌的血管生成中起到重要的作用。

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中圖分類號R 739．65

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1464－04

基金項目：安徽省科技廳重點資助課題（編號：12070403060）

作者單位：安徽醫科大學第二附屬醫院耳鼻咽喉科，合肥230601

作者簡介：瞿帥，男，碩士研究生；楊見明，男，主任醫師，責任作者，E-mail：jmyang88＠163．com試劑盒、30%聚丙烯酞胺凝膠單體儲液（Acr-BIS）、Tris-Hcl（pH＝6．8）、10%SDS、過硫酸銨、TEMED、5 ×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、一抗、二抗稀釋液購自上海碧云天生物有限公司；人IL-17和VEGF-A ELISA檢測試劑盒均購自美國R＆D公司。

The role of IL-17 and its receptor in invasion and metastasis of laryngeal cancer

Qu Shuai，Song Yang，Mei Jinyu，et al
（Deptof Otorhinolaryngology，The Second Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230601）

AbstractObjectiveTo investigate IL-17 and its receptor regulate JAK／STAT3 signaling pathway in the angiogenesis of laryngeal cancer．MethodsSerum levels of IL-17 and VEGF-A were determined in 70 laryngeal carcinoma patients using ELISA．The levels aswellas clinicopathological featureswere analyzed．Western blotassaywas used to detect the expressions of IL-17，IL-17R，JAK1／2，p-JAK1／2，STAT3，p-STAT3，VEGF-A，COX-2，MMP-9 in 70 cases of laryngeal carcinoma．Statisticsmethods were applied to analyze the results．Resu ltsSerum levels of both IL-17 and VEGF-A levels in patients were related to the degree of differentiation of laryngeal cancer，lymph nodemetastasis and TNM stage（P＜0．05），were unrelated to age，sex，primary tumor site．Western blot analysis showed that at different times in developmentof laryngeal cancer，with the deterioration of laryngeal cancer，IL-17，IL-17R expression gradually increased，JAK1／2，p-JAK1／2，STAT3，p-STAT3，VEGF-A，COX-2 and MMP-9 expressions were also significantly increased．ConclusionIL-17 may play an important role in angiogenesis of laryngeal cancer via regulating JAK／STAT3 signaling pathway．

Key wordsIL-17；laryngeal cancer；JAK／STAT3 signaling pathway